Vliv biologické úpravy povrchu vybraných implantačních materiálů na proliferaci a syntetickou aktivitu kostních buněk. Studie in vitro

Overview

Cíl:
pomocí pokusů in vitro studovat vliv povrchových vlastností vybraných implantačních materiálů na adherenci některých krevních složek (plazma, sérum) a sledovat vliv těchto adsorbovaných proteinů na povrchu implantátu na adhezi i syntetickou aktivitu kultivovaných osteoblastů.

Metodika:
U zvolených materiálů : titan leptaný (Ti-Etch), titan plazma-sprayovaný (Ti-PlaSpray), titan s hydroxyapatitovou vrstvou (Ti-HA), a uhlíkový kompozit (C/C) byly stanoveny fyzikálně-chemické parametry povrchu (drsnost, smáčivost a volná povrchová energie). Jako kontrola sloužil polystyren kultivačních destiček pro tkáňové kultury (TCPS). Biologická úprava materiálů byla provedena pokrytím jednou ze dvou vybraných krevních komponent–plazma nebo sérum. Na materiálech bez pokrytí i s biologickou úpravou byly kultivovány osteoblasty a následně byla z mitochondriální oxidační aktivity monolayeru buněk (MTT test) vyhodnocena jejich proliferace. V získaném kultivačním médiu byla pomocí enzymoimunosorbentní analýzy (ELISA) stanovena aktivita osteoblastů jako hladina kostní alkalické fosfatázy (BAP) a produkce zánětlivých cytokinů (TNF-α, IL-8).

Výsledky:
Vysoká drsnost implantátů ovlivnila zvýšenou proliferaci u titanových materiálů (Ti-PlaSpray). Nízká proliferace C/C je přičítána téměř nulové hodnotě polární složky povrchové energie. Potažení materiálů aktivovanou plazmou (fibrinovou sítí) vedlo ke vzniku unifikovaného povrchu jak z hlediska proliferace, tak i z hlediska syntetické aktivity. Oproti tomu při potažení implantátů sérem (albuminem) nebyl pozorován takový stimulační efekt na osteoblasty jaký jsme předpokládali.

Závěr:
Pokrytí vybraných implantačních materiálů aktivovanou plazmou (tj. fibrinovou sítí) vede k vytvoření povrchu s potřebnou rovnováhou mezi mírou proliferace a syntetickou aktivitou osteoblastů jako modelu imunitní odpovědi organizmu na zavedený implantát.

Klíčová slova:
implantační materiály, povrchové vlastnosti, sérum, plazma, proliferace, syntetická aktivita, osteoblasty, fyzikálně-chemické parametry, cytokiny

1. ÚVOD

Implantáty jsou materiály, které jsou používány pro doplnění chybějící tkáně téměř ve všech odvětvích medicíny. Velmi často slouží implantáty jako náhrada pojivové kostní tkáně. Po zavedení implantátu do tkáně dochází k vzájemné reakci cizího implantačního materiálu a živé tkáně. Na každý implantát reaguje tkáň jako na cizí těleso, protože dosud neexistuje materiál, který by ve tkáni oboustranné reakce nevyvolával (1, 2). Jejich intenzita a průběh jsou závislé na aktivitě fyzikálně-chemického i mechanického dráždění tkáně v okolí implantátu a klíčovou roli v těchto procesech mají fyzikálně-chemické parametry povrchu materiálů (3).

Místem prvního kontaktu mezi cizorodým implantačním materiálem a živou tkání příjemce je krev. Povrch implantátu je po kontaktu s krví modifikován aktivitou krevních buněk a mechanismem výměny iontů i proteinů (4). Při interakcích mezi povrchem implantačního materiálu a buňkami v in vitro podmínkách předchází adhese proteinů vždy adhezi buněčné a rovněž interakce povrchu materiálu s krví jsou regulovány fyzikálně-chemickými vlastnostmi implantátu (5). Proto je viabilita buněk v nejbližším okolí implantátu v přítomnosti různých krevních komponent důležitým krokem k porozumění procesu vhojování. Krev obsahuje množství plazmatických bílkovin, které spolu s krevními elementy zajišťují homeostázu. Tekutou fázi krve představuje po odstranění buněk plazma, a tato zbavená fibrinogenu tvoří sérum. Abychom zjistili zda přítomnost vybraných krevních složek ovlivní integraci implantačního materiálu do okolní tkáně, rozšířili jsme in vitro model „tkáň-implantát“, o přirozenou biologickou vrstvu krevních bílkovin (albumin, fibrin). Tímto modelem implantátu s biologickou úpravou povrchu jsme se pokusili o vytvoření prostředí, které názorněji imituje situaci in vivo a lépe umožní odpovědět na otázku, které krevní složky stimulují osteoinduktivní procesy, případně evokují zánětlivý efekt při vhojování implantátů do kosti.

2. MATERIÁL A METODIKA

2.1. Použité materiály

Pro testování byly zvoleny následující materiály: titan leptaný (Ti-Etch, Fopos, Praha ČR), titan plazma-sprayovaný (Ti-PlaSpray, Beznoska, Kladno, ČR), titan s hydroxyapatitovou vrstvou (Ti-HA, Lasak, Praha, ČR) a uhlíkový kompozit složený z uhlíku s horní vrstvou tvořenou tlakově zpolymerovanými plošně spletenými uhlíkovými vlákny ve fenolové pryskyřici (C/C, Ústav mechaniky a struktury hornin AV ČR, Praha). Mechanická úprava povrchů byla provedena u daného materiálu jeho výrobci. Jako kontrolní povrch byly zvoleny standardně používané polystyrénové kultivační nádoby (TCPS, Nunc A/S, Roskilde, Dánsko).

Testované materiály byly proprány v ultrazvukové lázni v ethanolu a v deionizované vodě (30 min). Před použitím byly materiály určené pro stanovení povrchových parametrů i materiály pro experimenty s buněčnými kulturami za standardních podmínek autoklávovány.

2.2. Stanovení fyzikálně - chemických parametrů povrchů

U povrchů materiálů byla sledována jejich drsnost, smáčivost ve vodě (kontaktní úhel) a volná povrchová energie (γ).

Měření drsnosti povrchů materiálů: Drsnost povrchu vzorků byla měřena přístrojem Hommeltester 1000T (Hommelwerke, SRN). Byly sledovány tyto základní povrchové charakteristiky: R_a- střední aritmetický průměr výšky profilu; R_z - průměrná střední výška profilu v 5 měřených úsecích; R_max – maximální jednotlivá hloubka drsnosti z 5 měřených úseků.

Smáčivost povrchu materiálů– Povrchové napětí vody bylo měřeny metodou visící kapky (přístroj OCA 20 vybaven video-kamerou, Dataphysics, Filderstadt, SRN). Smáčivostpovrchu byla stanovena na základě hodnot postupujícího (θ_A, měřeno při ponořování vzorku) a ustupujícího (θ_R, měřeno při vynořování vzorku)kontaktního úhlu ve vodě měřením dynamickou metodou Wilhelmyho destičky (tensiometer Kruss K12, Hamburg, SRN).

Volná povrchová energie (γ) byla stanovena určením smáčivosti ve třech rozpouštědlech o různých interakčních parmetrech (voda, formamid dijodomethan). Hodnoty kontaktních úhlů (θ) byly získány měřením kontaktních úhlů statickou kapkovou metodou (přístroj OCA 20 vybaven video-kamerou, Dataphysics, Filderstadt, SRN). Průměrná hodnota θ získaná fitováním Young-Laplace rovnicí byla použita k výpočtu volné povrchové energie γ a její polární γ^P a dispersní složky γ^D podle OWCK metody.

2.3. Biologická povrchová úprava materiálů

Pro kultivace osteoblastů byly použity implantáty kruhového tvaru o průměru 20 mm a tloušťce 1mm. Biologická úprava materiálů byla provedena pokrytím povrchu implantátu jednou ze dvou vybraných krevních komponent vždy ve stejný den, těsně před vložením buněk na materiály podle následujících postupů:

Potahování krevním sérem – vzorky byly inkubovány 60 minut s lidským sérem (Cambrex, Bio Sci, USA) při pokojové teplotě. Poté bylo přebytečné sérum odsáto a vyměněno za pufrovaný fyziologický roztok, pH = 7,4.

Potahování plazmou – zmražená lidská CPD plazma s přídavkem citrátu (ÚHKT, Praha, ČR) byla rozmražena ve vodní lázni při teplotě 37 ºC. Poté byl přidán chlorid vápenatý na vyvázání stabilizačního citrátu za účelem aktivace koagulační kaskády (vytvoření fibrinové sítě). Byl proveden test rychlosti tvorby koagula na modelovém TCPS povrchu. Vzorky byly ponořeny do aktivované plazmy a po 6 minutách inkubace byla plazma postupně odsávána za současného přilévání fyziologického roztoku pH = 7,4 tak, aby nedošlo ke vzniku krevního koagula. Po úplném nahrazení plazmy byly vzorky následně 3krát promyty fyziologickým roztokem a vloženy do kultivačních jamek.

2.4. Buněčné kultivace

2.4.1. Stanovení proliferace osteoblastů                    

Lidské osteoblasty (NHOst, Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., USA) byly kultivovány v kultivačním mediu (OGM BulletKit, Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.,) do 3.–4. pasáže. Implantáty byly za sterilních podmínek vloženy na dno 6jamkových kultivačních destiček (Nunc A/S, Roskilde, Dánsko). Osteoblasty byly v jednotlivých testech inokulovány na povrch implantátů v průměrném počtu 15 000 buněk/cm² a kultivovány za standardních podmínek po dobu 4 dnů (6). Pro další stanovení bylo použito jak získané kultivační médium, tak i sklizené buňky.

Míra proliferace osteoblastů byla stanovena z mitochondriální oxidační aktivity monovrstvy buněk po 4denních kultivacích na testovaných materiálech za použití MTT testu podle Laughtona (7). Souběžně s MTT testem na implantátech byl proveden stejný MTT test pro získání kalibrační křivky z koncentrační řady osteoblastů vložených do jamek polystyrenových destiček (TCPS) bez přítomnosti implantačních materiálů (7, 8). Díky tomuto postupu jsme mohli získané hodnoty absorbance pro snadnější orientaci vyjádřit jako počet buněk / ml média.

Buněčné kultivace osteoblastů byly opakovány ve 3 nezávislých experimentech vždy s novou inokulací osteoblastů a se třemi paralelními vzorky pro každý typ povrchu. Jako kontrola pro všechna stanovení sloužila kultivace osteoblastů na TCPS s odpovídající biologickou povrchovou úpravou. Pro porovnávání výsledků mezi různými typy potažení i mezi třemi opakovanými nezávislými pokusy byl počet adherovaných buněk přepočten na %. Jako referenční hodnota 100 % byl zvolen počet buněk rostoucích na kontrolním TCPS pro každou sadu povrchů (nepotažené, potažené sérem nebo plazmou) v jednotlivých experimentech.

2.4.2. In vitro stanovení syntetické aktivity osteoblastů.

Hladiny exprese vybraných cytokinů byly kvantitativně sledovány v kultivačním mediu osteoblastů po 4 dnech kultivace na testovaných materiálech pomocí „sandwich“ enzymo-imunosorbentní analýzy (ELISA) s komerčně dostupnými kity fy. Bender (MedSystems, Vídeň, Rakousko). Byla stanovena produkce kostní specifické alkalické fosfatázy (BAP), prozánětlivého cytokinu tumor necrosis faktor (TNF-α) a zánětlivého chemokinu (IL-8).

Pro porovnávání výsledků mezi různými typy potažení i mezi třemi opakovanými nezávislými pokusy bylo množství produkovaných cytokinů získané metodou ELISA (BAP v U/l na 100 000 buněk, IL-8 a TNF-α v ng/ml na 100 000 buněk) přepočteno na procenta (%). Jako referenční hodnota 100 % byla zvolena hladina cytokinu produkovaného na kontrolním TCPS. Tato referenční hodnota 100 % byla zavedena vždy zvlášť pro každou sadu povrchů (nepotažené, potažené sérem nebo plazmou) v jednotlivých experimentech.

2.5. Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM)

Vzorky pro SEM byly připraveny paralelně se vzorky pro buněčné experimenty. Po ukončení potahování aktivovanou plazmou byly vzorky převedeny etanolovou řadou do čistého etanolu, vysušeny a mikroskopovány pomocí digitálního rastrovacího mikroskopu VEGA TESCAN.

3. VÝSLEDKY A DISKUSE

3.1. Charakterizace fyzikálně-chemických vlastností povrchu

Data získaná měřením drsnosti, hodnoty volné povrchové energie i její polární γ^P a dispersní γ^D složky a hodnoty kontaktních úhlu jsou uvedeny v tabulce 1. Sledované povrchy jsou seřazeny podle klesající hodnoty polární složky γ^P povrchové volné energie γ^P, která je považována za jeden z důležitých faktorů ovlivňujících biologické interakce (9, 10).

Z důvodu lepší přehlednosti je prezentován jako parameter drsnosti jenom střední aritmetický průměr výšky profilu R_a jako hlavní ukazatel míry nerovnosti povrchu. Depozice další titanové vrstvy nebo bioaktivního hydroxyapatitu plazmatickým nástřikem na původní hladký titanový povrch (R_a = 0,15 ± 0,024 μm) vedla ke vzniku materiálů s vysokou drsností a současně s vysokou nehomogenitou (odchylka v R_a přes 20 %). Metoda plazmatické depozice titanu vedla k povrchu s nejvyšší drsností (R_a = 14,5 ± 2,74 μm) což má za cíl zejména zvětšení kontaktní plochy implantátu se živou tkání (9). Taktéž povrchová úprava uhlíkového kompozitu vedla ke vzniku nehomogenního povrchu, avšak s nižší drsností (R_a = 2,68 ± 0,585 μm). Na druhé straně proces chemické úpravy leptáním titanu povrchu roztokem o konstantním chemickém složení (Ti-Etch) umožnil připravit povrch o relativně vysoké homogenitě se standardní odchylkou pod 10 %.

U sledovaných materiálů byly pozorované velké rozdíly ve volné povrchové energii γ^P (7,23 až 70,21 mN/m). Nejvyšší hodnota γ a γ^P byla naměřena u TCPS (což odpovídá nejlepší proliferaci, viz kap. 3.2.). I když hodnoty γnebyly měřeny kvůli vysoké drsnosti povrchu uTi-PlaSpray přímo, zařazení Ti-PlaSpray za TCPS v tabulce 1. mělo následující důvod: když uvážíme, že γ je dána povrchovými vlastnostmi založenými na fyzikálně-chemických interakcích na úrovni atomů, pak hodnoty volné povrchové energie získané pro leštěný titan a to γ= 47,01 γ^P± 1,54 (mN/m), γ^P = 15,97 ± 0,54 (mN/m) a γ^D = 31,05 ± 0,98 (mN/m) (11), by v přiblížení mohly být aplikovány i pro titanové povrchy upravené na různou drsnost. Extrémně nízké hodnoty parametrů γ^P a γ^D byly stanoveny u titanu s horní anorganickou hydroxyapatitovou vrstvou, nicméně γ^Pparametr u Ti-HA má relativně vysokou hodnotu 4,62 mN/m. Další nekovový povrch, tj. C/C kompozit, je charakterizován hodnotou γ = 47,08 mN/m, ale s téměř nulovou hodnotou γ^P (což odpovídá nejhorší proliferaci, viz kap. 3.2.).

Smáčivost povrchů vodou je považována za jeden z hlavních faktorů odrážející míru adheze buněk na umělý povrch (11). TCPS a leptaný titan Ti-Etch s kontaktními úhly θ_A pod 70º reprezentují relativně smáčivé povrchy. V případě TCPS se jedná o speciální povrchovou úpravu výrobcem. U leptaného titanového povrchu je vysoká smáčivost způsobena hydratovanou TiO₂ vrstvou vytvořenou v průběhu leptání směsí kyselin. Vysoký kontaktní úhel θ_A u Ti-PlaSpray vzorků je důsledkem vysoké drsnosti povrchu, když u původního leštěného Ti byla naměřena θ_A= 62º (12). Nekovové povrchy Ti-HA a C/C kompozit představují hydrofobní povrchy s θ_A přes 90º bez pozorovaného vlivu drsnosti na smáčivost.

Následně byla provedena vizualizace povrchů nepotažených i potažených krevní plazmou pomocí rastrovací elektronové mikroskopie (SEM). Na obrázku 1 jsou zobrazeny povrchy testovaných materiálů potažené aktivovanou plazmou, tj. fibrinovou sítí, která vzniká síťováním fibrinu po vyvázání stabilizačního citrátu přítomného v plazmě. Potažení sérem, tj. albuminem není možné vizualizovat pomocí SEM, protože tato metoda neumožňuje zvětšení potřebné pro vizualizaci vrstev proteinů.

3.2. Proliferace osteoblastů

Proliferace osteoblastů kultivovaných na čistých nepotažených vzorcích a na implantačních materiálech potažených biologickou vrstvou je znázorněna na obrázku 2 . Buněčná proliferace byla podle očekávání na všech sledovaných nepokrytých materiálech ve srovnání s kontrolním polystyrenem (TCPS) nižší (obr. 2, skupina „bez potažení“). U většiny těchto povrchů však byla pozorovaná vysoká proliferace, a to zejménaz důvodu přidání osteokonduktivní anorganické vrstvy v případě Ti-HA, nebo zavedení funkčních skupin zvyšujících hydrofilitu stejně jako povrchovou drsnost v případě leptaného titanu (Ti-Etch). Vysoká povrchová drsnost vedoucí ke zvětšení povrchu dostupného pro adhezi v případě plazmatického nástřiku titanu (Ti-PlaSpray) společně s vysokou hodnotou polární složky γ^P pro titanový povrch také způsobila zvýšení proliferace. Na druhé straně nízká proliferace pozorovaná na uhlíkovém kompozitu je z hlediska fyzikálně-chemických vlastností způsobená téměř nulovou hodnotou polární složky γ^P volné povrchové energie a vysokou hydrofobicitou povrchu. Tento povrch je možné považovat za negativní kontrolu v naší studii.

Na vytvoření biologické vrstvy byly použity 2modelové systémy a to potažení sérem (tj. albuminem) a potažení aktivovanou krevní plazmou (tj. fibrinovou sítí). Z hlediska chemického původu povrchu implantátu jsme zjistili, že u vzorků Ti-Etch a C-C kompozitu v podstatě nebyly detekovány žádné signifikantní změny bez ohledu na typ biologického potažení. U povrchů Ti-PlaSpray bylo pozorováno mírné zvýšení proliferace ve srovnání s původním povrchem jen u potažení aktivovanou plazmou. Pouze potažení vzorků Ti-HA oběma typy krevních komponentů vedlo ke vzniku povrchů s výrazně vyšší proliferací osteoblastů, dokonce vyšší než u kontrolního TCPS.

Z hlediska typu potažení je možné vyvodit následující závěry (obr. 2). Pokrytí aktivovanou krevní plazmou, tj. fibrinovou sítí, vedlo ke vzniku povrchů se srovnatelně vysokou proliferací bez ohledu na původní materiál pod vrstvou plazmy. Na druhé straně, potažení sérem (albumin) nemá podobný stimulační efekt na proliferaci osteoblastů tak, jako bylo pozorováno v případě vzorků potažených plazmou.

3.3. Syntetická aktivita osteoblastů

V kultivačním médiu osteoblastů rostoucích 4 dny na původních materiálech i na materiálech s biologickou úpravou byla kvantitativně sledována hladina exprese vybraných tkáňových mediátorů. Za ukazatele osteoblastické aktivity byla zvolena kostní specifická alkalická fosfatáza (BAP) jako biochemický marker kostního metabolismu (13). Za ukazatele zánětlivé reakce byly zvoleny tumor necrosis faktor alfa (TNF-α) jako hlavní mediátor zánětlivých reakcí, který má silný cytotoxický a katabolický účinek (14) a interleukin 8 (IL-8), tj. prozánětlivý chemokin zvyšující expresi adhezivních molekul na povrchu buněk (15). Výsledky jsou prezentovány na obrázcích 3–5.

Z hlediska původního chemického složení povrchů byla pozorována u nepotažených materiálů vzrůstající tendence v expresi BAP (obr. 3) v řadě Ti-HA → Ti-Etch → Ti-PlaSpray → C/C kompozit což je ve shodě s klesající proliferací na daných materiálech (obr. 2). Z hlediskabiologického potaženístejná exprese BAP, srovnatelná s TCPS kontrolou, je pozorována u potažení aktivovanou plazmou (analogicky s proliferací) (vyjma C/C kompozitu). Žádné signifikantní změny produkce BAP bez ohledu na typ biologického potažení nebyly detekovány u Ti-Etch. U povrchu Ti-PlaSpray bylo pozorováno snížení exprese BAP jen u potažení aktivovanou plazmou. Pouze pokrytí vzorků C/C kompozitu oběma typy krevních komponentů nevedlo ke změnám v produkci BAP. Obdobné závěry jako pro BAP byly nalezeny též pro zánětlivý chemokin IL-8 (obr. 4).

V případě produkce TNF-α jsou na obrázku 5 uvedeny výsledky jenom z jedné kultivace osteoblastů, jelikož výsledky ostatních ELISA analýz ze zbývajících dvou kultivací byly velice rozporuplné. Data na obrázku 5 mají spíše informativní charakter a jakékoliv obecné závěry by byly zavádějící. Jediným závěrem je, že zatímco pokrytí implantačních materiálům sérem vedlo ke snížení produkce TNF-α , potažení plazmou mělo vliv opačný.

4. ZÁVĚR

Vysoká proliferace byla na nepotahovaných površích způsobena osteokonduktivní vrstvou v případe Ti-HA, přítomností funkčních skupin zvyšujících hydrofilitu a drsnost u Ti-Etch a díky vysoké drsnosti materiálu Ti-PlaSpray. Na druhé straně nízká proliferace byla nalezena u C/C kompozitu, kvůli jeho téměř nulové hodnotě polární složky γ^P povrchové energie.

Buněčná proliferace je nižší na nepotažených površích ve srovnání s TCPS kontrolou. Potažení aktivovanou plazmou (fibrinovou sítí) vedlo ke vzniku unifikovaného povrchu se srovnatelnou proliferací osteoblastů. Oproti tomu, sérum (albumin) nemá takový stimulační efekt na osteoblasty jak jsem předpokládali.

Při hodnocení syntetické aktivity byla zjištěna vzrůstající tendence v expresi markeru osteoblastické aktivity BAP u nepotažených materiálů v řadě Ti-HA → Ti-Etch → Ti-PlaSpray → C/C kompozit u všech vzorků, což odpovídá klesající proliferaci. Obdobná situace je pozorována u zánětlivého chemokinu IL-8. Z pokusů je možné vyvodit, že potažení plazmou, tj. fibrinovou sítí vede k unifikaci povrchů jak z hlediska proliferace, tak i z hlediska syntetické aktivity.

Závěrem je možné konstatovat, že pokrytí aktivovanou plazmou (tj. fibrinovou sítí) vede k povrchu s potřebnou rovnováhou mezi mírou proliferace a syntetické aktivity osteoblastů jako modelu imunitní odpovědi organismu na zavedený implantát.

Práce byla podpořena grantem IGA MZCR No. 8829 – 3 / 2006

prom. biolog Vlasta Pešáková

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2

e-mail: pesakova@seznam.cz