Současný pohled na imunopatogenezi myasthenia gravis

Overview

Myasthenia gravis (MG) je autoimunitní onemocnění, v jehož důsledku dochází k poruše nervosvalového přenosu. Dřívější představy o dominující roli patologických autoprotilátek namířených proti cílovým antigenům (nikotinovému acetylcholinovému receptoru, svalově specifické tyrozinkináze a nízkodenzitnímu lipoproteinovému receptoru) byly korigovány nálezem imunitní dysregulace na úrovni T lymfocytů –⁠ mezi Th1 a Th2 a/ nebo mezi T regulačními lymfocyty a Th17 buňkami, proliferací CD8+ lymfocytů, chemokinů, cytokinů a dalších molekul. K dysfunkci imunitního systému může dojít na různých úrovních imunitní odpovědi: pomocné CD4+ T lymfocyty, cytotoxické CD8+ T lymfocyty, regulační CD4+CD25+ T lymfocyty, Th17 lymfocyty, B lymfocyty i plazmatické buňky. Dominující roli v imunopatologických dějích má u mladších pacientů thymus, u nemocných starších se uplatňují extrathymické mechanizmy. Odlišné imunopatologické mechanizmy působí u myasthenie asociované s thymomem.

Klíčová slova:
myasthenia gravis –⁠ thymus –⁠ autoprotilátky –⁠ T lymfocyty –⁠ B lymfocyty –⁠ cytokiny

Úvod

Myasthenia gravis (MG) je onemocnění nervosvalového přenosu charakterizované kolísavou slabostí a unavitelností příčně pruhovaných svalů. MG je autoimunitní onemocnění, kde několik typů autoprotilátek pod vlivem buněčných imunitních mechanizmů interferuje se strukturami nervosvalového spojení, které mohou vést k poruše jeho funkce [1].

Imunopatogeneze MG

Imunopatogeneze onemocnění je komplexní. Autoimunitní nemoci mají ně­kte­ré společné vlastnosti, z čehož vyplývá, že k jejich rozvoji vedou společné patogenní mechanizmy. Predisponující jsou faktory genetické, epigenetické, hormonální, nedostatek vitaminu D a možné spouštěcí faktory (infekce, chronický stres), které interagují s imunitním systémem. MG je autoprotilátkami zprostředkovaná nemoc, kde kromě patologie thymu hraje, dle poznatků z poslední doby, podstatnou roli i dysregulace pomocných a regulačních T lymfocytů [1].

Thymus a MG

Thymus je lymfoepiteliální orgán, jehož hlavní úlohou je maturace T lymfocytů (tzv. thymopoeza), tj. selekce buněk, které vytvoří repertoár zralých T buněk, a zároveň delece lymfocytů, jež reagují s auto­antigeny [2]. Zásadní je rozlišovat mezi nethymomatózní (bez přítomnosti nádoru thymu –⁠ thymomu) a thymomatózní (paraneoplastickou) formou MG. U nethymomatózní formy MG se jedná z histopatologického hlediska buď o folikulární hyperplazii, nebo atrofii thymu.

Nethymomatózní autoimunitní forma MG

U mladších pacientů s protilátkami proti acetylcholinovému receptoru (AChR) dochází v thymu k indukci exprese AChR, která následuje po jeho uvolnění z thymických myoidních buněk. Myoidní buňky jsou u MG zdrojem antigenních epitopů, které jsou v kontextu s molekulami MHC II. třídy rozpoznávány T buněčnými receptory autoreaktivních CD4+ T lymfocytů jako cizorodé. V součinnosti se zánětlivými cytokiny dochází k aktivaci dalších autoreaktivních T lymfocytů, ale i B lymfocytů, které se vymknou kontrole T regulujících lymfocytů. To způsobí jak v thymu, tak i na periferii stimulaci specifických B lymfocytů, které produkují protilátky proti AChR. Dochází k novotvorbě drobných arteriol, jež napomáhají zvýšené atrakci lymfocytů do lymfoidních orgánů. Morfologickým důsledkem je tvorba germinativních center na rozhraní dřeně a kůry brzlíku s tzv. folikulární hyperplazií [2]. V nich jsou nahromaděny autoreaktivní T a B lymfocyty, hlavně fenotypy CD4+/ CD8 –⁠ a CD4 –⁠ / CD8+. Dřeňové epiteliální struktury obsahují nezralé formy svalových buněk (myoidní buňky), na kterých jsou lokalizovány AChR [3]. Předpokládá se, že autoagresivní reakce proti AChR může být iniciována přímo v thymu a že germinální centra jsou evidentně místo, kde dochází k protilátkové odpovědi B lymfocytů proti AChR [4]. Celá řada studií prokázala v hyperplastickém thymu navíc další důležité procesy, které odrážejí intenzivní aktivaci imunitního systému. V hyperplastickém thymu jsou na rozdíl od kontrolních thymů přítomny buňky produkující zánětlivé cytokiny jako IL‑12, IFN-gama, IL‑1 a IL‑6 [5]. Tento nález folikulární hyperplazie je patrný zejména u nemocných mladšího věku (do 45 –⁠ 50 let) s tzv. séropozitivní formou AChR + MG. Až u 50 % séronegativních pa­cientů, kteří nemají autoprotilátky proti AChR, se v thymu nalézají změny popisované jako „thymitis like“ infiltráty, což jsou podobné změny jako u folikulární hyperplazie thymu séropozitivních pa­cientů s MG, jen počet germinativních center je výrazně nižší [6]. U starších pa­cientů je zřetelná atrofie (involuce) thymu, v imunopatogenezi se účastní extrathymické mechanizmy.

Thymomatózní paraneoplastická forma MG

Asi 10 –⁠ 15 % pacientů má MG asociovanou s thymomem (MGAT) [7], 1/ 3 z nich tvoří maligní thymomy s invazivním růstem. Imunopatogeneze MGAT je heterogenní, uplatňují se jak centrální imunitní mechanizmy (thymus, thymom), tak periferní extrathymické mechanizmy. Paraneoplastická MGAT začíná v thymomu vývojem abnormálních netolerogenních T lymfocytů vůči AChR, které se následně exportují do periferních imunitních orgánů (lymfatické uzliny, slezina, kostní dřen a často i normální thymus mimo thymomu). Tady dochází k aktivaci T lymfocytů, k interakcím s B lymfocyty a nakonec k produkci autoprotilátek proti AChR [8]. To také vysvětluje fakt, proč po odstranění thymomu i s reziduální tkání thymu nedochází k poklesu titru protilátek proti AChR [9]. Všechny thymomy u pa­cientů s MG také vyplavují zralé naivní T lymfocyty do periferie a zejména autoreaktivním CD4+ T lymfocytům se přičítá významná role v patogenezi MGAT [10]. Proto při léčbě MGAT má kromě thymektomie rozhodující význam imunosupresivní léčba. Autoimunitní regulátor (AIRE) je transkripční faktor, který je produkován subpopulací medulárních epiteliálních buněk thymu a je nevyhnutný pro expresi tkáňově specifických antigenů, takže se považuje za klíčový faktor v centrální toleranci thymu. U většiny MGAT byly nalezeny hrubé defekty v expresi AIRE [11], nicméně byly také pozorovány u thymomů, které nebyly spojeny s MG, což naznačuje, že samotný nedostatek AIRE nevede k rozvoji MG.

Autoprotilátky

Patologické autoprotilátky jsou v cca 80 % případů namířeny proti nikotinovému AChR na postsynaptické membráně nervosvalové ploténky (AChR + MG) nebo v 5 –⁠ 10 % proti svalově specifické tyrozinkináze (MuSK, MuSK + MG). V roce 2011 byly u japonských myasteniků objeveny nové autoprotilátky proti receptoru, který je spojen s nízkodenzitním lipoproteinem (Low ‑⁠ density lipoprotein 4; Lrp4), následně byly referovány i v Německu a USA [12]. Existují i tzv. séronegativní formy onemocnění, kde běžně dostupnými metodami neprokážeme v séru žádné známé protilátky asociované s MG. U této formy se velmi pravděpodobně jedná o velmi nízké titry výše uvedených cirkulujících autoprotilátek (tzv. nízkoafinitní protilátky), které nejsou detekovatelné dostupnými metodami.

V důsledku aktivace autoreaktivních B lymfocytů dochází k produkci protilátek proti AChR, které se zpočátku vážou na dva sousední receptory a následně blokují a destruují AChR tzv. membrány atakujícím komplexem. Aktivuje se komplement, oxid dusíku a zánětlivé cytokiny. Dochází k internalizaci AChR, vyhlazení junkčních záhybů, redukci AChR a následné blokádě nervosvalového přenosu. Pokud není zničení AChR kompenzováno jeho zvýšenou syntézou, důsledkem je snížení funkčních AChR na post­synaptické membráně, což vede k manifestaci myastenických příznaků [13]. Autoprotilátky proti AChR jsou polyklonální a hlavně z podskupin IgG1 a IgG3 (komplement aktivující). Z klinického hlediska titry protilátek jsou mezi pacienty značně variabilní a jejich hodnoty nekorelují s klinickou závažností MG. U pacientů léčených imunosupresivy mohou být protilátky proti AChR falešně negativní nebo se jejich hladina může snížit. Po plazmaferéze rovněž dochází k snížení hladiny protilátek spolu s klinickým zlepšením [14]. Protilátky proti AChR jsou často nalezeny i u pa­cientů s dlouhodobou klinickou remisí [15].

Pacienti s thymomem mají ve většině případů pozitivní protilátky proti AChR [16]. Naopak falešně pozitivní protilátky proti AChR můžeme nalézt u pacientů s thymomem bez MG, přičemž jejich nález nijak nepredikuje vznik MG [17]. Je popisován výskyt protilátek proti AChR i u jiných autoimunitních chorob.

Imunopatologický vliv autoprotilátek je zřejmý u 80 –⁠ 85 % nemocných. Tato forma choroby se označuje jako séropozitivní AChR + MG. U 40 % tzv. séronegativních pacientů byly nalezeny protilátky proti MuSK, což je povrchový transmembránový receptorický protein, který je součástí membrány svalového vlákna a má podstatnou roli pro zabudování AChR do postsynaptické membrány nervosvalové ploténky, tzv. clustering (shlukování) AChR [18]. Hoch et al v roce 2001 zjistili, že část pacientů se séronegativní formou MG má autoprotilátky proti MuSK, hlavně třídy IgG4 [19]. Autoprotilátky jsou namířeny proti extracelulární části MuSK a způsobují inhibici aktivace MuSK indukované agrinem, tzn. poruchu agregace, clusteringu AChR a následně postsynaptické selhání neuromuskulární transmise. U pa­cientů s protilátkami proti MuSK je thymus většinou atrofický. Nejnovějším objevem na poli výzkumu autoprotilátek u MG jsou již zmiňované anti‑Lrp4 protilátky, které patří hlavně do podtříd IgG1 a IgG2. Lrp4 je člen rodiny strukturně příbuzných transmembránových proteinů, které vykonávají různé funkce ve vývoji nervosvalového spojení, vč. signální transdukce a receptorem zprostředkované endocytózy. Lrp4 je specificky exprimován v dobře diferencovaných myotubulech a je soustředěn na nervosvalové ploténce [20]. Extracelulární doména molekuly Lrp4, která slouží jako funkční receptor, je v interakci s agrinem a tato vazba aktivuje MuSK, což vede k tvorbě většiny agregátů obsahujících AChR v junkční oblasti plazmatické membrány [21]. Lrp4 a MuSK mohou tvořit komplex i v nepřítomnosti ligandu agrinu, nicméně agrin prostřednictvím vazby na Lrp4 zvyšuje interakci mezi Lrp4 a MuSK [22,23]. Velká mezinárodní studie [24] odhalila, že podíl těchto autoprotilátek u tzv. dvojitě séronegativních pacientů (anti‑AChR negat., anti‑MuSK negat.) tvoří až 19 % z celkového počtu. U většiny pacientů s nálezem thymomu se nacházejí protilátky antistriatální (ScMAb), které způsobují postižení svalových vláken s mikroskopickým nálezem lymforhagií. Tyto protilátky reagují s epitopy na svalových bílkovinách titinu, ryanodinového receptoru, kortaktinu a dalších, a dle některých autorů můžou korelovat se závažností MG [25]. Klasifikace MG zahrnuje jednak povahu protilátek, věk nástupu onemocnění a zapojení thymu (tab. 1). MG je prototyp autoimunitního onemocnění s přítomností receptorově specifických protilátek.

Účast jednotlivých subpopulací lymfocytů na imunopatogenezi MG

T lymfocyty –  buněčná odpověď specifické imunity

AChR ‑⁠ reaktivní CD4+ T buněčné klony, které se nacházejí v thymu a periferní krvi, hrají důležitou roli v patogenezi MG tím, že pomáhají B lymfocytům produkovat anti‑AChR protilátky [26,27]. AChR ‑⁠ specifické CD4+ T buňky jsou přítomny v krvi pacientů s MG, ale jsou obzvláště bohaté na brzlíku, což podporuje myšlenku, že k autosenzibilizaci T buněk dochází v thymu [28]. Studie, které využívají model buněčného přenosu u experimentální autoimunitní MG (EAMG) ukazují stěžejní roli AChR specifických CD4+ T buněk na rozvoj EAMG. Thymektomie a specifická terapie monoklonálními protilátkami proti CD4+ T lymfocytům zlepšuje klinické příznaky u tohoto modelu, což dokazuje, že CD4+ T buňky mohou být zapojeny v iniciaci humorální autoimunitní odpovědi u MG [29]. Po transplantaci fragmentů thymu nebo směsi lymfocytů od pa­cientů s MG produkují SCID myši protilátky proti lidským AChR a manifestuje se u nich myastenická slabost. Tyto nálezy prokazují, že autoreaktivní CD4+ T buňky jsou nezbytně nutné pro produkci patogenních protilátek proti AChR [30].

Z hlediska periferních mechanizmů autotolerance je velmi důležitou skupinou CD4+ T lymfocytů subpopulace regulačních buněk, které jsou charakterizovány molekulami CD4, CD25 a Foxp3 (transkripční faktor). CD4+CD25+ (T-regulační lymfocyty) mají nejdůležitější roli v udržování autotolerance a potlačení rozvoje autoimunity [31]. Snížení buněčné aktivity Treg je popisováno u pacientů s různými autoimunitními onemocněními [32]. Tak např. funkční aktivita cirkulujících CD4+CD25+ T buněk byla u pacientů s RS nižší ve srovnání se zdravými kontrolami [33]. Jejich mechanizmus účinku ochrany organizmu před T lymfocyty zprostředkovanými autoimunitními nemocemi je buď přímý inhibiční účinek na B lymfocyty nebo nepřímo přes inhibici diferenciace T pomocných lymfocytů [34,35].

Vzhledem k faktu, že CD4+CD25+ regulační T buňky jsou thymického původu a hrají důležitou roli při rozvoji autoimunitních onemocnění, je zajímavé zkoumat jejich role v patogenezi MG. Aricha at al pozorovali, že se v periferní krvi u myastenických potkanů nachází významně nižší počet Treg v porovnání se zdravými kontrolami a že Treg buňky od zdravých dárců mohou suprimovat EAMG u hlodavců [36]. Rovněž Treg buňky od myastenických potkanů jsou méně účinné než Treg buňky od zdravých kontrol [37]. Pacienti s MG mají funkční deficit thymických Treg buněk [38]. Množství Treg buněk dle některých autorů dramaticky narůstá po thymektomii a koreluje se zlepšením klinických příznaků [39]. Také kortikoidy vedou k zlepšení funkční aktivity Treg buněk.

T lymfocyty, které exprimují na svém povrchu molekulu CD8 a antigen rozpoznávají v kontextu molekul MHC I. třídy, představují tzv. cytotoxické CD8+ T lymfocyty. Jejich role v imunopatogenezi MG není zcela jasná. Mají spíše regulující funkci. CD8+ T lymfocyty jsou zapojeny do zastavení destruktivního účinku zánětlivé odpovědi a udržení vlastní imunotolerance; CD8+ T buněčná deplece zvyšuje vnímavost myší k EAMG [40]. Lisak et al ukázali, že deplece CD8+ T buněk z krevních mononukleárních buněk u pacientů s MG vedla ke zvýšené produkci autoprotilátek, což znamená, že autologní CD8+ T buňky vykazují určitou regulační kontrolu nad anti‑AChR CD4+ T buňkami u MG [41].

B lymfocyty a plazmatické buňky –  humorální odpověď specifické imunity

Zvýšený počet B buněk se nalézá v thymu u folikulární hyperplazie při SPMG s časným začátkem, a to hlavně u žen [42]. Poměrně typický nález, který svědčí pro účast humorálních mechanizmů v imunopatogenezi MG, je výskyt germinálních center v thymu. Zvýšené hladiny estrogenu nebo prolaktinu pravděpodobně umožňují autoreaktivním B buňkám vyhnout se mechanizmům tolerance, hromadit se a v dostatečném počtu způsobit autoimunitní onemocnění. Senzibilizované autoreaktivní B lymfocyty produkují protilátky zejména proti AChR. Wang et al zjistili, že u pokusných hlodavců s EAMG se buňky secernující autoprotilátky nacházejí v lymfatických uzlinách, slezině a thymu a přednostně jsou produkovány proti nativnímu AChR, a to hlavně alfa‑podjednotce [43]. Kromě toho, u pacientů s MG se objevily důkazy o klonální expanzi B lymfocytů ve srovnání s kontrolami [44]. Aktivační faktory B lymfocytů (APRIL (proliferaci indukující ligand B lymfocytů) a aktivační faktor B lymfocytů (B ‑⁠ cell Activating Factor; BAFF))jsou TNF‑like chemokiny, které podporují přežití a diferenciaci B buněk. Zvýšené sérové hladiny BAFF a APRIL můžeme najít u několika typů autoimunitních onemocnění –⁠ systémový lupus erythematodes (SLE), diabetes mellitus 1. typu, roztroušená skleróza, ale i u MG [45]. Inhibitory BAFF nebo BAFF/ APRIL byly již úspěšně použity u myšího modelu několika autoimunitních nemocí [46].

Bylo prokázáno, že belimumab, monoklonální protilátka, která neutralizuje BAFF, je účinná v léčbě SLE a rovněž již byla za tímto účelem schválena [47]. Fáze II klinické studie ověřující bezpečnost a klinický efekt u MG v současné době probíhá.

Cytokiny IL‑17, IFN‑ γ, TNF‑α a IL‑6

Interleukin 17 je tvořen paměťovými aktivovanými CD4+ T lymfocyty a pravděpodobně patří k časným iniciátorům zánětlivých reakcí závislých na T buňkách. Ukazuje se, že rovnováha mezi T-pomocnými buňkami (Th1, Th2, Th17 a Treg) je při rozvoji EAMG narušena tím, že dochází ke kolísání hladiny IL‑17, která při progresi onemocnění stoupá. Z toho vyplývá, že nerovnováha jednotlivých subpopulací pomocných T lymfocytů hraje u EAMG významnou roli a že patogenetické mechanizmy související s produkcí IL‑17 mohou představovat potenciální terapeutické cíle [48].

U pacientů s MG byly prokázány zvýšené hladiny IL‑17 [49] a rovněž u paraneoplastické formy MG byla popsána zvýšená frekvence výskytu IL‑17 produkujících CD4+ T lymfocytů, která dokonce korelovala s hladinami protilátek proti AChR [50]. Zvýšená produkce IL‑17 byla také popsána u folikulární hyperplazie při SPMG [51]. Podle nejnovějších poznatků IL‑17 produkující CD4+ T lymfocyty přispívají ke ztrátě tolerance B lymfocytů u experimentální autoimunitní MG [52].

Chronický zánět přítomný v thymech pacientů MG, který zahrnuje řadu cytokinů, jako je TNF‑α, IL‑17 a IFN ‑⁠ γ, zřetelně přispívá ke snížení počtu Treg buněk a dysregulaci jejich imunosupresivní aktivity. V mechanizmu této chronické imunitní aktivace hrají výše popisované cytokiny ústřední roli [53].

TNF‑α hraje klíčovou úlohu u imunoregulačních poruch pozorovaných u MG. Argumenty podporující tento závěr jsou: Hladina TNF‑α je významně zvýšená nejen v celém thymu, ale i v séru pa­cientů s MG a že i pacienti s lehčími formami onemocnění mají vysoké hladiny TNF‑α. To naznačuje, že u pacientů s MG je chronický nadbytek TNF‑α [54]. TNF‑α snižuje funkci Treg buněk. Anti‑TNF‑α léčba je úspěšná u mnoha experimentálních modelů autoimunitních chorob vč. EAMG a současně obnovuje supresivní funkce Treg [55].

Sekrece IL‑6 je odpověď na sekreci TNF‑α a IL‑1. Je produktem aktivovaných T lymfocytů, pro B lymfocyty je hlavním růstovým faktorem v závěrečných fázích jejich diferenciace. Podporuje tak tvorbu protilátek (je také růstovým faktorem pro plazmocyty). Některé studie ukázaly, že IL‑6 se podílí na rozvoji MG [56,57], což je v souladu s jeho činností jako promotoru B-buněčné diferenciace a proliferace, a následné indukci tvorby plazmatických buněk a protilátek [58]. Již dříve bylo prokázáno, že léčba protilátkou anti‑IL‑6 potlačuje probíhající MG u krys [59]. Je zajímavé, že IL6 –⁠ /  IL6 –⁠ myši jsou rezistentní k indukci EAMG [60]. Uznání role IL‑6 v imunopatogenezi některých autoimunitních onemocnění vedlo k použití monoklonální protilátky proti lidskému IL‑6 receptoru (tocilizumabu) pro léčbu revmatoidní artritidy, juvenilní idiopatické artritidy a Castlemanovy nemoci. Klinické účinky této léčby u pacientů s MG nejsou známy, zatím nebyl použit v klinických studiích. Jeden experimentální model prokázal, že léčba anti‑IL‑6 protilátkou potlačuje probíhající EAMG prostřednictvím mechanizmů, které zahrnují inhibici Th1, Th17 buněk a posléze i B buněk (schéma 1) [59].

Závěr

V posledních letech jsme svědky velkého pokroku v poznání imunopatologických dějů u autoimunitních chorob. U řady z nich nacházíme společné imunopatogenetické mechanizmy, které vedou k poruše funkce či k destrukci cílové tkáně. Zánětlivé prostředí v cílovém orgánu mění funkci a plasticitu CD4+ buněk, což vede k poškození funkce Treg lymfocytů. Tento mechanizmus je typický pro celou řadu autoimunitních onemocnění. Nové možnosti biologické terapie zaměřené na konkrétní cílový antigen dávají nové naděje pacientům s refrakterními formami jednotlivých autoimunitních onemocnění.

Tato práce vznikla za podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy v rámci projektu č. 351011/ 2011 s názvem „Klinická, laboratorní a socioekonomická analýza u pacientů s myasthenia gravis v České republice“. Dále byla podpořena výzkumným programem PRVOUK ‑⁠ P26/ LF1/ 4 a Specifickým vysokoškolským výzkumem č. 254260020.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Přijato k recenzi: 11. 9. 2015

Přijato do tisku: 27. 10. 2015

MUDr. Michala Jakubíková

Neurologická klinika a Centrum klinických neurověd

1. LF UK a VFN v Praze

Kateřinská 30

120 00 Praha 2

e-mail: michala.jakubikova@vfn.cz