Predikce reziduálního onemocnění po chemoterapii u pokročilých NSGCT –⁠ má mikroRNA klinický přínos?

Overview

Východiska: Standardním postupem u pokročilých neseminomových germinálních nádorů varlat (NSGCT) po kurativní chemoterapii je chirurgická resekce reziduálních retroperitoneálních mas (RPLND). Přibližně u 40–50 % pacientů je však v resekátu přítomna pouze nekróza nebo fibróza. Sérové mikroRNA představují perspektivní biomarkery germinálních nádorů, které by mohly přispět k identifikaci reziduálního viabilního nádoru po systémové léčbě. Cílem práce bylo zhodnotit diagnostickou výtěžnost vybraných mikroRNA při predikci histopatologického nálezu u pacientů indikovaných k RPLND po chemoterapii. Soubor pacientů a metody: V letech 2021–2023 byl na Masarykově onkologickém ústavu analyzován soubor 18 pacientů s NSGCT klinického stadia II a III po ukončení kurativní chemoterapie. U všech pacientů byla před zahájením chemoterapie a následně před plánovaným operačním výkonem (RPLND) a po něm analyzována hladina pěti specifických sérových mikroRNA (miR-371a-3p, miR-223-3p, miR-383-3p, miR-517a-3p a miR-519a-3p). Výsledky byly korelovány s definitivním histopatologickým nálezem v resekátu s cílem posoudit diagnostickou výtěžnost a prediktivní hodnotu těchto biomarkerů pro přítomnost viabilního tumoru, teratomu nebo nekrózy. Výsledky: Do analýzy bylo zařazeno 18 pacientů s pokročilým NSGCT. Nejčastějším výchozím klinickým stadiem bylo stadium IIB (33 %; n = 6) a IIC (22 %; n = 4). Histologické vyšetření reziduální tkáně po PC-RPLND prokázalo nekrózu u 55 % (n = 10), teratom u 38 % (n = 7) a viabilní nádor u 5 % (n = 1) pacientů. Dynamika sérových tumorových markerů alfa-fetoprotein (AFP), lidský choriový gonadotropin (hCG) a laktátdehydrogenáza (LDH) vykazovala v celém souboru očekávaný pokles po zahájení systémové terapie, který přetrvával i po provedení RPLND. Medián hladiny AFP klesl z hodnoty 17,4 před zahájením terapie na 3,7 před RPLND a dále na 2,5 po RPLND. Podobný trend byl pozorován i u hCG a LDH. ROC analýza miRNA jako potenciálních prediktorů teratomu nebo viabilního nádoru po RPLND neprokázala dostatečnou diskriminační schopnost žádné z hodnocených proměnných. Hodnoty plochy pod křivkou se u většiny miRNA pohybovaly v rozmezí 0,45–0,70 a žádný z testovaných modelů nedosáhl statistické významnosti. Závěr: Sérové mikroRNA v současnosti nedosahují dostatečné senzitivity ani specificity pro rozhodování o indikaci chirurgické resekce reziduálních mas po chemoterapii u pacientů s NSGCT. Přestože tyto biomarkery vykazují vysoký diagnostický potenciál v jiných fázích onemocnění, jejich využití v postchemoterapeutické indikaci zůstává zatím omezené a chirurgická resekce reziduálních mas nadále představuje standardní součást kurativního postupu.

Klíčová slova:

biomarkery – mikroRNA – retroperitoneální lymfadenektomie – NSGCT – germinální nádory varlat – miR-371a-3p – RPLND

Úvod

Nádory z germinálních buněk (germ cell tumors –⁠ GCT) představují nejčastější solidní malignitu u mladých mužů. Přibližně 20–25 % neseminomových germinálních nádorů varlat (non-seminomatous germ cell tumors of the testis –⁠ NSGCT) je diagnostikováno v klinickém stadiu II a dalších 15–20 % ve stadiu III. Díky vysoké citlivosti na systémovou léčbu založenou na cisplatině dosahují pacienti s pokročilým onemocněním vysoké pravděpodobnosti vyléčení. I v případě nepříznivé prognózy dle IGCCCG (International Germ Cell Cancer Collaborative Group) dosahuje tato skupina pacientů 5letého přežití bez progrese (progression-free survival –⁠ PFS) v 54 % a 5letého celkového přežití (overall survival –⁠ OS) v 67 % [1].

K posouzení efektu léčby se standardně využívá monitorace hladin sérových nádorových markerů (alfa-fetoprotein (AFP), lidský choriový gonadotropin (human chorionic gonadotropin –⁠ hCG), laktátdehydrogenáza (LDH)) a kontrolní CT vyšetření hrudníku, břicha a pánve, případně magnetická rezonance, prováděné 3–4 týdny po ukončení posledního cyklu léčby. Pokud po ukončení systémové terapie přetrvává v retroperitoneu reziduální ložisko o velikosti > 10 mm v transverzální rovině při současné negativitě nádorových markerů, je indikována chirurgická resekce –⁠ retroperitoneální lymfadenektomie (RPLND) [2–5]. Hlavním účelem tohoto výkonu je odstranění potenciálně viabilního tumoru nebo teratomu, který je rezistentní k chemoterapii a nese riziko další progrese (tzv. growing teratoma syndrome) či somatické transformace (histologická transformace teratomu do somatického maligního nádoru, např. sarkomu či karcinomu).

Zásadním klinickým problémem však zůstává nízká specificita současných zobrazovacích metod. Histologické vyšetření resekátu po 1. linii chemoterapie prokazuje nekroticko-fibrotické změny až u 40–50 % pacientů [6]. Tito pacienti jsou tak vystaveni riziku závažné perioperační morbidity, zahrnující zejména poškození sympatických nervových vláken s následnou retrográdní ejakulací a trvalou neplodností, aniž by z náročného výkonu měli přímý onkologický benefit. Současné konvenční biomarkery ani PET/CT nedokážou s dostatečnou přesností odlišit nekrózu od teratomu či viabilního nádoru v postchemoterapeutickém terénu [7].

V posledních letech se do popředí zájmu dostávají nové biomarkery na bázi mikroRNA (miRNA), zejména miR-371a-3p. Studie potvrzují její vysokou senzitivitu pro primární diagnostiku v rozmezí 93–96 %, specificitu blížící se 100 % a plochu pod křivkou (area under curve –⁠ AUC) 0,97–0,98 [8,9]. Nicméně její role v predikci histologie u reziduálních mas po chemoterapii zůstává kontroverzní. Dieckmann et al. ve své práci prokázali senzitivitu 68,9 % pro identifikaci viabilního tumoru, avšak limitem byly případy s nízkým zastoupením viabilní složky (< 10 %), které unikaly detekci [10]. Zásadní data přinesla studie Thor et al. (SWENOTECA-MIR), která demonstrovala výrazný rozdíl ve výtěžnosti markeru podle klinického kontextu. Zatímco u pacientů se seminomem podstupujících primární RPLND vykazovala miR-371a-3p vysokou senzitivitu (74 %) i specificitu (100 %), ve skupině s neseminomem po kurativní chemoterapii v indikaci PC-RPLND (Post-Chemotherapy Retroperitoneal Lymph Node Dissection) senzitivita pro detekci viabilního nádoru dramaticky klesla na pouhých 9 % [11]. Teratomy i nekroticko-fibrotická tkáň vykazují v testech na miRNA konzistentní negativitu, což jako hlavní limitaci potvrdila i recentní metaanalýza Kardousta et al. [12].

S ohledem na nekonzistentní výsledky dosavadních studií a potřebu validace těchto markerů v reálné klinické praxi jsme se zaměřili na zhodnocení prediktivního významu panelu pěti miRNA (miR-371a-3p, miR-223-3p, miR-383-3p, miR-517a-3p a miR-519a-3p) u pacientů s pokročilým NSGCT léčených na Masarykově onkologickém ústavu v Brně (MOÚ). Cílem práce bylo posoudit, zda dynamika hladin těchto miRNA před zahájením a po ukončení chemoterapie může zpřesnit indikaci k PC-RPLND a identifikovat pacienty, u kterých by bylo možné bezpečně zvolit observaci.

 

Soubor pacientů a metody

Soubor pacientů

V letech 2021–2023 byl na MOÚ retrospektivně analyzován soubor 18 pacientů s diseminovaným NSGCT v klinickém stadiu II–III po ukončení kurativní chemoterapie 1. linie. Inkluzním kritériem byla přítomnost reziduální retroperitoneální masy indikované k postchemoterapeutické RPLND (PC-RPLND) při normalizaci klasických sérových nádorových markerů (AFP, hCG, LDH). U všech pacientů byly z klinické dokumentace získány demografické a klinicko-patologické údaje, vč. věku v době diagnózy, histologie primárního tumoru a charakteru podané systémové léčby.

 

Odběr vzorků a analýza miRNA

Odběr séra k analýze miRNA probíhal ve spolupráci s Bankou biologického materiálu MOÚ u všech pacientů ve třech časových bodech –⁠ před zahájením chemoterapie, před plánovaným operačním výkonem (PC-RPLND) a v pooperačním období. Zkoumaný panel zahrnoval pět specifických miRNA (miR-371a-3p, miR-223-3p, miR-383-3p, miR-517a-3p a miR-519a-3p). Celková RNA byla izolována pomocí TRIZOL reagentu (Thermo Fisher Scientific, USA). Po izolaci RNA byla stanovena její čistota a koncentrace a proveden přepis do cDNA pomocí TaqMan™ Advanced miRNA cDNA Synthesis Kitu (Thermo Fisher Scientific, USA) s následnou preamplifikací 14 cyklů. Příslušné miRNA byly stanoveny pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (QuantStudio 5) s použitím TaqMan MicroRNA Assays (vše Thermo Fisher Scientific, USA). Dostupnost a kompletnost dat (kompletní, parciální vs. chybějící informace) u celého souboru 18 pacientů v jednotlivých fázích sledování je přehledně znázorněna na obr. 1.

Statistické zpracování

Kategoriální proměnné byly popsány absolutními a relativními četnostmi. Spojité proměnné byly charakterizovány mediánem a interkvartilovým rozpětím, případně rozsahem (min–max). K posouzení rozdílů mezi skupinami (nekróza vs. viabilní tumor/teratom) byl použit neparametrický Mann-Whitneyův test. Diagnostická výkonnost jednotlivých miRNA byla hodnocena pomocí ROC  (receiver operating characteristic) analýzy. Pro každý marker byla vypočtena AUC a stanovena optimální prahová hodnota (cut-off) na základě Youdenova indexu spolu s hodnotami senzitivity a specificity. Statistická významnost AUC každého markeru byla hodnocena jednostranným z-testem proti nulové hypotéze H₀: AUC = 0,5, přičemž standardní chyba AUC byla odhadnuta metodou dle Hanleyho et al. [13]. Analýzy byly provedeny v prostředí Python 3 s využitím knihoven scikit-learn (v. 1.8) a scipy (v. 1.17). Studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací a schválena Etickou komisí MOÚ.

 

Výsledky

Charakteristika souboru a histopatologický nález

Do retrospektivní analýzy bylo zahrnuto 18 pacientů s NSGCT (klinické stadium II–III). Podrobná demografická a klinicko-patologická charakteristika souboru je uvedena v tab. 1. Histologické vyšetření reziduální tkáně po PC-RPLND prokázalo u 10 pacientů (55,6 %) nekrózu, u sedmi pacientů (38,9 %) teratom a u jednoho pacienta (5,6 %) viabilní nádor somatického typu. Pro účely prediktivní analýzy byli pacienti s teratomem a viabilním nádorem sloučeni do jedné skupiny (n = 8).

Dynamika biomarkerů v průběhu léčby

Hladiny konvenčních nádorových markerů a sledovaného panelu miRNA v jednotlivých fázích léčby shrnuje tab. 2. Dynamika sérových tumorových markerů AFP, hCG a LDH vykazovala v celém souboru očekávaný pokles po zahájení systémové terapie, který přetrvával i po provedení RPLND. Medián AFP klesl z hodnoty 17,4 před zahájením terapie na 3,7 před RPLND a dále na 2,5 po RPLND. Podobný trend byl pozorován i u hCG a LDH. Zatímco u konvenčních markerů byl patrný postupný pokles jejich hladin v průběhu léčby, u miR-371a-3p došlo k výraznému snížení mediánu hladiny již před PC-RPLND (z 3,132 na 0,008).

Prediktory teratomu a viabilního nádoru (ROC analýza)

Výsledky ROC analýzy pro konvenční nádorové markery a panel miRNA jsou uvedeny v tab. 3. Analýza dynamiky miRNA markerů (miR-371a-3p, miR-223-3p, miR-383-3p, miR-517a-3p a miR-519a-3p) byla limitována neúplností dat a nízkým počtem validních měření v jednotlivých časových bodech. ROC analýza jednotlivých markerů hodnocených jako potenciální prediktory přítomnosti teratomu nebo viabilního nádoru po RPLND neprokázala dostatečnou diskriminační schopnost žádné z hodnocených proměnných. Hodnoty AUC se u většiny markerů pohybovaly v rozmezí 0,45–0,70 a žádný z testovaných modelů nedosáhl statistické významnosti.

Diskuze

Management pokročilých stadií NSGCT prošel v posledních desetiletích významným vývojem, jehož hlavním cílem zůstává maximalizace kurativního potenciálu při současné snaze o minimalizaci léčebné toxicity. Klíčovým bodem terapeutického algoritmu je hodnocení efektu iniciální chemoterapie. U pacientů, kteří dosáhnou parciální remise s reziduálním ložiskem > 10 mm v krátké ose a normalizovanými hladinami sérových nádorových markerů, zůstává standardem provedení PC-RPLND [14].

Hlavním klinickým dilematem je skutečnost, že u významné části těchto pacientů obsahuje reziduální ložisko pouze nekrózu či fibrózu, zatímco PC-RPLND představuje technicky náročný výkon spojený s rizikem perioperačních komplikací a dlouhodobé morbidity, zejména retrográdní ejakulace. Specifickou otázku představuje management reziduí ≤ 1 cm. V případě kompletní remise nebo parciální remise s reziduem < 1 cm je dle současných doporučení indikováno aktivní sledování. Role chirurgické resekce u těchto nálezů však zůstává kontroverzní, neboť přítomnost viabilního nádoru či teratomu nelze zcela vyloučit. Riziko recidivy při aktivním sledování se udává přibližně v rozmezí 6–9 %, což vyžaduje individuální rozhodování a pečlivou diskuzi s pacientem [15,16].

V tomto kontextu existuje zřejmá potřeba spolehlivého prediktivního biomarkeru, který by umožnil přesnou identifikaci pacientů s nekrotickými rezidui a potenciálně redukoval počet zbytečných chirurgických výkonů. Značná očekávání byla vkládána do cirkulujících miRNA, zejména do miR-371a-3p. Dosavadní studie prokázaly jejich vysokou diagnostickou přesnost v primodiagnostice germinálních nádorů, nicméně jejich role v postchemoterapeutickém nastavení zůstává nejasná.

Naše výsledky ukazují, že hladiny miR-371a-3p po ukončení chemoterapie klesají na minimální či nedetekovatelné hodnoty, a to i u pacientů s následně prokázaným teratomem v resekátu. Tento nález je v souladu s biologickými vlastnostmi teratomu, který cluster miR-371a neexprimuje. Současně se zdá, že ani u viabilní nádorové tkáně po chemoterapii nemusí být produkce cirkulujících miRNA dostatečná pro jejich spolehlivou detekci, což může souviset se změnami biologického chování nádorových buněk po expozici cytotoxické léčbě.

Zásadní limitací naší studie je malý počet pacientů a neúplnost dat v některých časových bodech, což omezuje statistickou sílu analýzy a neumožňuje formulovat definitivní závěry. Přesto jsou naše výsledky v souladu s publikovanými daty, která naznačují, že negativita miR-371a-3p po chemoterapii nemůže být v současnosti považována za dostatečné kritérium pro vynechání chirurgické resekce reziduálních mas.

Potenciálně perspektivní cestu představuje integrace cirkulujících miRNA s metodami strojového učení (machine learning) a radiomickými parametry z CT. Příkladem je studie Ozgun et al., která na souboru pacientů z biobanky British Columbia Cancer (GU176) prokázala, že kombinace radiomické signatury (tj. kvantitativních charakteristik extrahovaných z CT obrazu, popisujících texturu, heterogenitu a prostorové uspořádání nádorové tkáně) s rozšířeným panelem miRNA (zahrnujícím kromě miR-371a-3p také miR-375-3p, která je specifičtější pro teratomovou složku) výrazně zvyšuje přesnost predikce [17]. Jejich optimální model (CatBoost) dosáhl v nezávislém testovacím souboru AUC 0,83 (95% CI 0,68–0,98), přičemž radiomická signatura se ukázala být nejsilnějším nezávislým prediktorem (p < 0,0001). Tyto výsledky naznačují, že personalizace léčby po chemoterapii pokročilých NSGCT pravděpodobně nebude stát na jediném biomarkerovém testu, ale na komplexní integraci molekulárních a obrazových dat.

Navzdory limitovaným výsledkům v postchemoterapeutickém využití u pokročilých NSGCT vykazují miRNA v jiných klinických indikacích vysokou diagnostickou přesnost, která často převyšuje konvenční nádorové markery. V československém kontextu je významná práce Mego et al., která hodnotila klinickou využitelnost plazmatické miR-371a-3p u pacientů s germinálními nádory zahajujících systémovou chemoterapii. Autoři prokázali asociaci vstupních hladin miR-371a-3p s rozsahem onemocnění, rizikovou skupinou dle IGCCCG a léčebnou odpovědí, přičemž negativita miR-371a-3p byla spojena s lepším PFS a OS [18]. Slibné výsledky byly publikovány v oblasti primární diagnostiky malých testikulárních lézí (STMs < 2 cm). Studie Chavarriaga et al. prokázala senzitivitu 68–88 % pro detekci GCT i u velmi malých ložisek (medián 14 mm), kde jsou klasické sérové markery velice často negativní [19]. Další výsledky studií Fankhausera et al. a Belgeho et al. shodně potvrzují miR-371a-3p jako excelentní marker relapsu u germinálních nádorů klinického stadia I (CS I) v rámci sledování (follow up) [20,21]. Relaps onemocnění byl díky miR-371a-3p zachycen signifikantně dříve než u konvenčních markerů a často i s předstihem oproti zobrazovacím metodám. U pokročilejších stadií seminomů (CS IIA/B) vykazuje miR-371a-3p vysokou korelaci s histopatologickým nálezem v primární RPLND [11]. Tato vysoká prediktivní hodnota by mohla otevřít cestu k bezpečnější indikaci chirurgické léčby, resp. k eliminaci falešně pozitivních CT nálezů, které vedou k nadbytečnéléčbě.

 

Závěr

Ačkoliv miRNA představují perspektivní skupinu biomarkerů u germinálních nádorů, jejich využití v predikci histopatologického nálezu po chemoterapii u NSGCT je v současnosti limitované. Negativita miR-371a-3p po chemoterapii nemůže být považována za spolehlivé kritérium k vynechání chirurgické resekce. PC-RPLND tak i nadále zůstává standardní součástí kurativního postupu.

 

Dedikace

Práce byla podpořena MZ ČR –⁠ RVO (MOÚ, 00209805) a projektem LM2023033 –⁠ Síť českých biobank (BBMRI.cz).