Protinádorový potenciál celistvých rastlinných funkčných potravín u rakoviny prsníka

Overview

Východiská: Celistvé rastlinné potraviny sú bohatým zdrojom širokého spektra bioaktívnych funkčných substancií –⁠ fytochemikálií, s rozsiahlym aditívnym a/alebo synergickým pôsobením v rámci procesu karcinogenézy. Vďaka rastúcemu počtu dôkazov z predklinických štúdií o ich účinnosti a relatívne bezpečnom toxikologickom profile je ich možné považovať za vhodnú stratégiu prevencie či doplnkovej terapie nádorových ochorení. Cieľom našej štúdie bolo porovnať protinádorovú kapacitu rozličných zmesí fytochemikálií obsiahnutých v celistvých rastlinných funkčných potravinách, konkrétne v šalvii (Salvia officinalis L.), arónii (Aronia melanocarpa L.) a rakytníku (Hippophae rhamnoides L.), a to v chemopreventívnom modeli rakoviny prsníka u samíc potkanov. Materiál a metódy: Fytofarmaká boli zvieratám podávané v potrave v rámci troch nezávislých experimentov v dvoch koncentráciách –⁠ 1) v nižšej –⁠ 0,1% alebo 0,3% (skupina 0,1 alebo 0,3), a 2) v 10-násobne vyššej –⁠ 1% alebo 3% (skupina 1 alebo 3). V tretej skupine fytofarmaká zvieratám podávané neboli, slúžila ako kontrola (KONT). Po ukončení každého experimentu bola uskutočnená analýza základných parametrov experimentálnej mamárnej karcinogenézy a komplexná analýza dobre validovaných prognostických, prediktívnych a diagnostických biomarkerov používaných v onkologickej praxi aj v predklinickom výskume. Výsledky: Komplexná analýza mechanizmu účinku rastlinných funkčných potravín potvrdila ich signifikantné protinádorové účinky v nami použitom experimentálnom modeli karcinómu prsníka, ktoré boli však špecifické od použitého fytofarmaka. Fytofarmaká signifikantne zlepšili parametre mamárnej karcinogenézy in vivo –⁠ incidenciu, frekvenciu, latenciu nádorov, a/alebo pomer HG/LG karcinómov. Štatisticky významne zlepšili expresiu markerov apoptózy, proliferácie, angiogenézy, nádorových kmeňových buniek a onkogénnych/tumor-supresorových miRNA. Naviac, chemoprevencia viedla k významnej modulácii chemických zmien histónov a poklesu metylácie promótorových oblastí tumor-supresorových génov. Záver: Porovnaním účinnosti fytofarmák sme dospeli k záveru, že prítomnosť špecifických dominantných rastlinných metabolitov môže priaznivo ovplyvniť prognózu mamárnej karcinogenézy. Na potvrdenie týchto zistení je však nevyhnutný ďalší predklinický a klinický výskum, vrátane posúdenia potenciálu týchto látok ako adjuvantnej terapie popri štandardnej onkologickej liečbe.

Klíčová slova:

rakovina prsníka – epigenetika – chemoprevencia – fytofarmakum

Úvod

Rakovina prsníka patrí dlhodobo medzi najčastejšie diagnostikované nádorové ochorenia u žien [1]. Predklinické štúdie naznačujú, že zvýšený príjem celistvých rastlinných potravín bohatých na bioaktívne fytochemikálie môže byť spojený so zníženým rizikom jej vzniku [2–5]. Cieľom našej štúdie preto bolo analyzovať protinádorový potenciál troch rastlinných funkčných potravín –⁠ šalvie (Salvia officinalis L.), arónie (Aronia melanocarpa L.) a rakytníka (Hippophae rhamnoides L.) –⁠ v chemopreventívnom modeli karcinómu mliečnej žľazy u samíc potkanov. Na základe dostupných poznatkov sme predpokladali, že uvedené rastlinné funkčné potraviny budú vykazovať protinádorový účinok prostredníctvom synergického pôsobenia ich fytochemických zložiek na parametre nádorového rastu, diferenciácie a molekulové regulačné dráhy súvisiace s progresiou nádoru.

Materiál a metódy

Experimenty boli schválené Etickou komisiou JLF UK (EK1860/2016, EK1860/ 2022) a ŠVPS SR. Panenské samice potkana kmeňa Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Nemecko) boli náhodne rozdelené do troch skupín po 25 zvierat. Mamárna karcinogenéza bola indukovaná i.p. aplikáciou N-metyl-N-nitrozourey (50 mg/kg) na 42. postnatálny deň, čím sa modeloval premenopauzálny stav u žien s vysokým rizikom rakoviny prsníka. Fytofarmaká boli podávané v potrave (SSNIFF, Nemecko) v koncentráciách 0,1/0,3 % (nižšie dávky) a 1/3 % (vyššie dávky), kontrolná skupina (KONT) liečbu nedostávala. Dávkovanie vychádzalo z klinických odporúčaní a predchádzajúcich experimentov [6–9]. V prípade šalvie bol do formy fytofarmaka spracovaný prášok z vňate Salvia officinalis L. (Calendula, Nová Ľubovňa, Slovensko; miesto pôvodu: severovýchodné Slovensko), v prípade ostatných fytofarmák to bol prášok zo šupiek plodov Aronia melanocarpa L. a Hippophae rhamnoides L. (Zamio, Michalovce, Slovensko; pôvodom z regiónu Zemplín) [10–12]. Experiment trval 15 týždňov. Po eutanázii boli nádory odobraté, zmerané a fixované vo formalíne alebo RNAlateri na histologické a molekulárne analýzy. Hodnotila sa incidencia, frekvencia, latencia a pomer HG/LG karcinómov. Imunohistochemické stanovenie markerov apoptózy, proliferácie, angiogenézy, CSCs a histónových modifikácií sa realizovalo pomocou Autostainer Link 48 a komerčných protilátok (Thermo Fisher, Abcam, Dako a i.), vizualizácia prebiehala cez systém EnVision s DAB substrátom. Morfometria bola vykonaná v softvéri QuickPhoto Micro 3.0. Expresia miRNA sa stanovovala RT-PCR (TaqMan testy, AB7500) alebo pomocou microarray analýzy (Agilent). Methylácia tumor-supresorových génov sa hodnotila pyrosekvenáciou (PyroMark, Qiagen). Dominantné fytochemikálie boli identifikované LC-DAD/MS a LC-MS analýzou. Štatistické vyhodnotenie zahŕňalo ANOVA, Kruskal–Wallis a Mann–Whitneyov test.

Výsledky

V preklinickom modeli chemicky indukovanej mamárnej karcinogenézy u potkanov preukázali celistvé rastlinné potraviny –⁠ šalvia, arónia a rakytník –⁠ protinádorové účinky sprostredkované moduláciou apoptózy, proliferácie, angiogenézy, expresie nádorových kmeňových buniek a epigenetických dráh.

Podávanie vybraných rastlinných potravín viedlo k zníženiu podielu nízkodiferencovaných karcinómov (graf 1A), čo dokazuje zlepšenie prognózy a zvýšeniu pomeru Bax/Bcl-2 (graf 1B), čo naznačuje aktiváciu apoptózy. Súčasne klesla expresia markerov Ki67 a VEGF, poukazujúc na potlačenie proliferácie a angiogenézy (graf 1C,D). Tieto nálezy podporujú hypotézu, že rastlinné bioaktívne látky môžu priaznivo ovplyvniť nádorovú biológiu prostredníctvom viacerých regulačných mechanizmov.

Naviac, chemoprevencia signifikantne zlepšila expresiu onkogénnych/tumor-supresorových miRNA, viedla k významnej modulácii chemických zmien histónov a poklesu metylácie promótorových oblastí tumor-supresorových génov, avšak tieto dáta v rámci tejto štúdie neboli detailnejšie analyzované [10–12].

Diskusia a záver

Celistvé rastlinné potraviny ako šalvia, arónia a rakytník preukázali významný protinádorový účinok v chemopreventívnom modeli rakoviny prsníka u potkanov, čo sa pripisuje synergickému pôsobeniu ich fytochemikálií na viaceré bunkové dráhy [4,5]. Naša analýza klinicky relevantných biomarkerov potvrdzuje, že fytofarmaká môžu priaznivo ovplyvniť prognózu karcinómu prsníka [13,14]. Napriek sľubným výsledkom má použitý model viaceré obmedzenia. Indukovaná mamárna karcinogenéza u potkanov poskytuje cenné poznatky, no nereflektuje plne komplexitu ľudskej rakoviny pre rozdiely v metabolizme, imunite a genetickej variabilite. Laboratórne podmienky navyše znižujú mikrobiálnu expozíciu, čo môže ovplyvniť liečebnú odpoveď. Variabilita zloženia rastlinných extraktov závislá od pôvodu a spracovania tiež komplikuje štandardizáciu a klinické využitie. Hoci hlodavčie modely odhaľujú základné mechanizmy účinku, ich translačný potenciál je obmedzený a vyžaduje doplnenie o pokročilejšie systémy, ako sú 3D kultúry či PDX modely. Napriek tomu výsledky poskytujú dôležitý dôkaz o biologickej aktivite rastlinných potravín s potenciálom ovplyvniť nádorovú progresiu in vivo.

Výsledky tejto štúdie poukazujú na potenciál rastlinných funkčných potravín ako doplnkovej stratégie v prevencii karcinómu prsníka a zároveň sú v súlade s výsledkami našich predchádzajúcich štúdií využívajúcich rovnaký experimentálny model [6–9]. Pre ich translačné uplatnenie je však potrebné rozšíriť výskum o rôzne modely, zohľadniť fytochemickú variabilitu a presnejšie definovať mechanizmy účinku, optimálne dávkovanie a spôsob podávania. Ich efektívne využitie v klinickej praxi predpokladá integráciu do konceptu prediktívnej, preventívnej a personalizovanej medicíny (3PM).

Dedikácia: Práca bola finančne podporené grantom VEGA-1/0045/23 a VEGA-1/0286/22.