Povrchové markery leukemických kmenových buněk u chronické myeloidní leukemie

Souhrn

I přes značný pokrok v léčbě chronické myeloidní leukemie (CML) pomocí tyrozin-kinázových inhibitorů (TKI) dosáhne pouze ~ 40 % pacientů setrvalé remise po vysazení léčby. Jednou z příčin je perzistence leukemických kmenových buněk (leukemic stem cell – LSC), které jsou rezistentní vůči léčbě a přežívají v quiescentní formě v kostní dřeni. LSC tak představují rezervoár pro obnovu nemoci a zdroj mutací, které mohou vést k rezistenci na léčbu a relapsu onemocnění. Ideálním cílem terapie je proto úplná eradikace nemoci vč. LSC, což je problematické kvůli nedostatku terapeutických cílů a vůbec detekci těchto velmi raritních buněk. Proto jsou předmětem intenzivního výzkumu markery leukemických kmenových buněk, které by je umožnily snadněji odlišit od zdravé populace kmenových buněk, přinesly by nové poznatky o samotné bio­logii LSC, a zároveň posloužily jako potenciální terapeutické cíle. Tato práce shrnuje recentní poznatky z probíhajícího výzkumu a klinických studií týkajících se problematiky povrchových markerů LSC u CML.

Klíčová slova:

chronická myeloidní leukemie – leukemické kmenové buňky – markery leukemických kmenových buněk

ÚVOD

Chronická myeloidní leukemie (CML) je klonální myeloproliferativní onemocnění, které je charakteristické kumulací granulocytů a jejich prekurzorů v kostní dřeni a periferní krvi. Roční incidence onemocnění se pohybuje okolo 0,7 případů na 100 000 obyvatel, věkový medián při dia­gnóze je kolem 57 let [1–3]. Onemocnění se vyznačuje přítomností tzv. chromozomu Philadelphia [4], který je výsledkem translokace t (9; 22) (q34; q11) a nese fúzní onkogen BCR:: ABL1 (Breakpoint Cluster Region:: Abelson 1) [5–7]. Jeho produktem je konstitutivně aktivovaná tyrozinkináza. Ta interaguje s řadou intracelulárních signálních drah, které hrají významnou roli v onkogenní transformaci a proliferaci leukemických buněk u CML [8]. K samotné onkogenní transformaci dochází ve stádiu hematopoetické kmenové buňky (haematopoietic stem cell – HSC), která svou proliferační aktivitou zajišťuje nejen vznik leukemické populace, ale díky mechanizmům sebeobnovy udržuje populaci zásobních LSC. První přímý důkaz přítomnosti této populace u CML pacientů přinesla studie z roku 1999, kdy se podařilo izolovat a identifikovat vysoce (reverzibilně) quiescentní subpopulaci leukemických buněk, která nesla znaky kmenovosti jak v in vitro, tak in vivo podmínkách [9].

V současnosti je díky dostupnému spektru inhibitorů tyrozinové kinázy (TKI) možné nasadit a změnit léčbu podle individuální potřeby pacientů, což u většiny z nich vede k téměř úplné eradikaci leukemických buněk [10]. Ke vzniku rezistence na TKI terapii dochází jen u přibližně 10–15 % pacientů, přičemž jednou z nejčastějších příčin je zisk mutací v BCR:: ABL1 kinázové doméně [11]. Díky genetické nestabilitě a akvizici nových chromozomálních abnormalit může nastat i progrese do akcelerované a blastické fáze CML, k čemuž v současnosti dochází pouze u cca 4 % pacientů [3,12]. Při dosažení dlouhodobé optimální léčebné odpovědi se nyní přistupuje k vysazení TKI, které bývá úspěšné u 40 % pacientů a kterému bylo věnováno přehledové sdělení na stránkách předkládaného časopisu [13]. U zbylých pacientů dochází k návratu nemoci a je potřeba u nich léčbu obnovit [14–17]. Hlavní příčinou těchto relapsů je přítomnost populace přežívajících LSC, které jsou rezistentní k apoptóze indukované TKI [18]. LSC se nacházejí převážně v kostní dřeni, ale jsou detekovatelné i v periferní krvi zároveň se zdravými hematopoetickými kmenovými buňkami, se kterými sdílejí své hlavní fenotypové vlastnosti a povrchové markery [19]. Stejně tak s nimi sdílejí řadu bio­logických vlastností, jako je schopnost sebeobnovy a diferenciace do převážně myeloidní, ale i lymfoidní řady. Odlišení LSC od HSC a pochopení jejich bio­logie se tak staly kritickými faktory pro umožnění cílené terapie, která by vedla k úplné eradikaci nemoci [20].

Vzhledem k tomu, že LSC jsou schopné dlouhodobě přetrvávat u pacientů na TKI terapii, je patrné, že jejich přežívání není zcela závislé na aktivitě BCR:: ABL1, jako je tomu u vývojově nižších stádií leukemické krvetvorby [21,22]. Díky pokrokům v molekulární bio­logii a novým metodám, jako je sekvenování na úrovni jednotlivých buněk, byly identifikovány BCR:: ABL1 nezávislé dráhy, které u LSC vedou k rezistenci na léčbu TKI. Souhrnným výsledkem působení těchto drah u LSC je potlačení signálů pro apoptózu, podpora proliferace a zvýšení sebeobnovovací schopnosti [23]. LSC jsou podporovány i samotným mikroprostředím kostní dřeně, které vytváří příznivé prostředí pro přežívání a růst leukemické populace.

Tato přehledová práce je zaměřena na nejnovější poznatky na poli problematiky fenotypu LSC a jejich povrchových markerů u CML.

POVRCHOVÉ MARKERY LEUKEMICKÝCH KMENOVÝCH BUNĚK U CML

Jako povrchové markery jsou označovány molekuly proteinů a sacharidů nacházející se na vnější straně plazmatické membrány buněk. Tyto molekuly obecně slouží pro přenos buněčné signalizace a mezibuněčnou komunikaci.

HSC i LSC jsou fenotypově řazeny do populace primitivních buněk charakteristických expresí povrchového markeru CD34 [19]. U pacientů v chronické fázi CML tato populace tvoří cca 10 % z celkových mononukleárních/jaderných buněk v kostní dřeni a 5 % v periferní krvi. Převážná část této frakce je tvořena BCR:: ABL1 pozitivními blasty CD34+CD38+, zatímco CD34+CD38- LSC a HSC jsou zastoupeny pouze minoritně (cca 0,01 % z CD34+ frakce) [24]. V blastické fázi CML byly buňky s LSC vlastnostmi navíc detekovány i v hierarchicky nižších populacích společných myeloidních progenitorů CD34+CD38+CD45RA-CD123+ (common myeloid progenitors – CMP), dále progenitorů pro granulocyty a makrofágy CD34+CD38+CD45RA+CD123+ (granulocyte-macrophage progenitors – GMP), a progenitorů pro megakaryocyty a erytrocyty CD34+CD38+CD45RA- -CD123- (megakaryocyte-erythroid pro- ge­­nitors – MEP). I přestože se tyto buňky získáním schopností sebeobnovy a iniciace leukemie funkčně stanou LSC, stále si zachovávají svůj původní imunofenotypový profil, čímž se liší od kmenových buněk. Prozatím nebyly nalezeny povrchové markery, které by je odlišily od zdravých progenitorů, což je příčinou obtížnější cílené eradikace [25,26].

Pro odlišení LSC od HSC u CML pacientů bylo teprve v průběhu posledních 10 let testováno několik markerů (tab. 1), z nichž ně­kte­ré byly použity i v klinických studiích (tab. 2).

Jedním z nejlépe popsaných specifických LSC markerů je CD26 [24,27,28]. Jedná se o proteázu nacházející se na povrchu buněk ve formě transmembránového proteinu II. typu. V aktivní homodimerové formě katalyticky štěpí proteiny a peptidy s prolinem, alaninem nebo serinem na předposlední aminokyselinové pozici od N-konce [29].

Hlavní popsanou funkcí CD26 u LSC je přerušení signální dráhy SDF-1-CXCR4, která normálně rekrutuje hematopoetické buňky do kostní dřeně. CD26 štěpí chemotaxin SDF-1, a zvyšuje tak mobilitu a vyplavování leukemických buněk do periferní krve. Jeho povrchová exprese u LSC je specifická pro CML, zatímco u dalších leukemických malignit, např. u akutní myeloidní leukemie (AML), je minimální. Kromě LSC je u CML minoritně detekovatelný u bazofilů a lymfocytů [27].

Při sledování povrchové exprese CD26 při dia­gnóze a v průběhu TKI léčby u CML pacientů bylo ukázáno, že při dia­gnóze jsou CD26+ LSC detekovatelné téměř u 100 % pacientů jak v kostní dřeni, tak periferní krvi. V průběhu léčby dochází k výrazné redukci CD26+ LSC až na hranici detekce, nicméně tyto buňky mohou být stále identifikovatelné i u ně­kte­rých pacientů v hluboké molekulární odpovědi (deep molecular response – DMR) [28]. Také se ukázalo, že CD26+ LSC nesou BCR:: ABL1, zatímco CD26- LSC jsou BCR:: ABL1 negativní a že vyšší procento detekovaných CD26+ LSC v době dia­gnózy koreluje s pozdějším dosažením velké molekulární odpovědi (major molecular response – MMR) [24]. Díky těmto pozorováním se CD26 stal předmětem probíhajících klinických studií, které jsou zaměřeny na a) sledování poklesu či nárůstu CD26+ LSC v průběhu léčby a b) cílenou léčbu CML pacientů, např. pomocí kombinace léčby TKI s vildagliptinem, který by měl eradikovat přetrvávající LSC populaci (tab. 1).

Dalším významným specifickým markerem CML LSC je IL-1RAP, který je koreceptorem pro IL1 a IL33. Je součástí signálních drah zapojujících se do procesů zánětu a buněčné proliferace [30]. U CML pacientů bylo objeveno vysoké procento IL-1RAP pozitivních CD34+CD38- kmenových buněk, zatímco stejná populace u zdravých jedinců byla IL-1RAP negativní. U IL-1RAP, stejně jako u CD26, byla potvrzena schopnost rozdělovat populaci kmenových buněk na BCR:: ABL1 pozitivní a negativní [31]. Landberg et al. ukázali, že procento IL-1RAP+ buněk koreluje s nádorovou zátěží, a tak by mohlo u pacientů sloužit k predikci dosažení molekulární a cytogenetické odpovědi [32]. V publikaci Zhao et al. pak popsali, že s progresí CML se u LSC zvyšuje zastoupení IL-1RAP+ buněk [33]. Tento marker se také nachází na leukemických buňkách u pacientů s AML, a to vč. LSC. Díky svým vlastnostem, podporujícím růst leukemických buněk, je studován jako potenciální terapeutický cíl [34].

CD25 je třetím významným markerem CML LSC. Pro identifikaci LSC je často používán v kombinaci s CD26 a IL-1RAP. CD25 je alfa podjednotkou heterotrimerového receptorového komplexu pro IL2. Je členem imunoglobulinové rodiny a slouží jako adhezní protein pro mezibuněčnou interakci a také pro interakci mezi buňkami a extracelulární matrix. U CML LSC bylo popsáno, že CD25 působí jako negativní regulátor růstu a při léčbě TKI dochází k snížení jeho exprese na úrovni mRNA [35]. CD25 je selektivně exprimován pouze u LSC, v porovnání s HSC, a lze ho při dia­gnóze detekovat až u 90 % pacientů. CML LSC zvýšeně exprimují pouze alfa podjednotku CD25, beta a gama podjednotka nejsou dostatečně exprimovány, což v důsledku vede k tomu, že nedochází ani k aberantní aktivaci IL-2 dráhy. Exprese CD25 je podle Sadovnika et al. spouštěna přes STAT5, který je pozitivně regulován BCR:: ABL1 kinázou. V průběhu TKI léčby tak blokací BCR:: ABL1 signalizace dochází ke snížení CD25 exprese a ztrátě CD25+ LSC [36].

Dalšími markery, které jsou zmiňované v souvislosti s LSC u CML, jsou CD33, CD36, CD93 a CD123. Tyto markery jsou většinou využívány v kombinaci s ně­kte­rým z předcházejících tří markerů.

Marker CD33, transmembránový receptor vážící sialovou kyselinu, byl u CML LSC popsán ve studii Herrmanna et al., kde ukázali, že v čase dia­gnózy je CD33 exprimována na povrchu LSC a leukemických progenitorů, zatímco v průběhu léčby procento CD33+ buněk klesá. CD33 marker je však méně specifický, jelikož je možné nalézt CD33+ buňky i v HSC populaci [27].

Dalším markerem je CD36, vysoce glykosylovaný transmembránový protein, exprimovaný u celé řady buněk, především u trombocytů a adipocytů, kde slouží jako receptor pro trombospondin. Je zapojen do řady buněčných procesů, jako jsou buněčná adheze, fagocytóza a reakce na zánět. U nádorových buněk obecně podporuje metastazování a rezistenci na terapii pomocí zvýšeného lipidového příjmu a oxidace mastných kyselin a je zapojen také do angiogeneze. V publikaci Landberga et al. našli v rámci CD34+CD38low CML populace zvýšený výskyt CD36+ buněk, v porovnání se stejnou populací ze zdravé kostní dřeně. Populace CD34+CD38lowIL1RAP+CD36+ vykazovala v buněčné kultuře stejný růst jako CD36- populace, ale byla signifikantně méně senzitivní vůči imatinibu. Tuto sníženou senzitivitu bylo možné překonat použitím nilotinibu a také využitím polyklonálních protilátek proti CD36, které indukovaly selektivní umírání pouze u leukemických buněk. V této studii také sledovali, že v průběhu TKI terapie dochází v CD34+CD38low populaci k výraznému snížení procenta CD36+ buněk [37]. Jeho role v patogenezi CML LSC dosud nebyla popsána, ovšem předpokládá se, že jeho účast v procesech udržování homeostázy adipózní tkáně by mohla mít vliv na mikroprostředí kostní dřeně, a podporovat tak růst a přežívání LSC. Tuto teorii podporují i výsledky studie Ye et al., která na myším modelu CML blastické fáze popsala specifickou CD36+ LSC subpopulaci v adipózní tkáni. Tato subpopulace byla chráněna okolním mikroprostředím vůči působení chemoterapeutik a zároveň využívala energetické zásoby této tkáně pro své přežití [38].

Zajímavým povrchovým markerem je CD90, vysoce N-glykosylovaný glykofosfatidylinositolový protein, který se účastní procesů, jako jsou buněčná adheze, migrace, apoptóza a mezibuněčná komunikace [39]. Původně byl zvažován jako samostatný specifický marker LSC, ale novější poznatky ukazují, že se spíše jedná o obecný marker odlišující více primitivní populace s vysokou schopností sebeobnovy u CML i AML [40,41].

Dalším povrchovým markerem je CD93, povrchový glykoprotein, který se účastní procesů, jako jsou mezibuněčná adheze a migrace leukocytů. Zatím pro něj ovšem nebyla navržena žádná specifická funkce u CML LSC. Kinstrie et al. ukázali, že CD93 se selektivně nachází u CD34+CD38-CD90+ populace, která má vlastnosti kmenových buněk. V průběhu léčby se sice procento CD93+ LSC snižovalo, ale tyto buňky byly stále detekovatelné a korelovaly s výskytem molekulárního relapsu u pacientů, kterým byla vysazena TKI léčba. Může tak být nástrojem pro rozpoznání pacientů hůře reagujících na vysazování TKI léčby, a stejně tak možným selektivním faktorem pro výběr kandidátů pro samotné vysazení [40].

Povrchový marker CD123 je alfa podjednotkou heterodimerového IL3 receptoru. Je zapojen do procesů buněčného zrání, dělení, přežívání a migrace buněk. Byla popsána jeho zvýšená exprese na povrchu LSC u hematologických malignit v porovnání s HSC [42]. Je jedním z důležitých markerů pro identifikaci LSC u AML [43]. Nievergall et al. navíc ukázali, že se procento CD123+ LSC zvyšuje s progresí CML. Dále v této studii pro inhibici CD123 použili CSL362, což vedlo k eradikaci CD123+ CML LSC a výrazně sníženému přihojování CML buněk v myších. Inhibice CD123 vedla k blokaci antiapoptické signální kaskády a eradikaci leukemických CML progenitorů pomocí TKI [44]. CD123 se tak jeví jako slibný marker pro LSC a pro cílenou terapii u CML v akcelerované fázi a blastické fázi.

Velkou porovnávací studií celé řady markerů u pacientů v chronické fázi je publikace Herrmann et al., která ukázala, že CML LSC mají téměř neměnný aberantní profil definovaný jako CD25+/CD26+/CD56+/CD93+/IL-1RAP+. Exprese ostatních LSC markerů popsaných v této rešeršní práci nebyla signifikantně odlišná od progenitorové populace a/nebo od HSC a progenitorů [45].

V našem souboru 35 CML pacientů jsme na populaci kmenových buněk (CD34+38-) z kostní dřeně testovali 7 vybraných markerů – CD25, CD26, CD56, CD69, CD90, CD93 a IL-1RAP. Výsledky průtokové cytometrie ukázaly, že CD25, CD26 a IL-1RAP mají vysokou, ale ne úplnou koexpresi, z čehož vyplývá, že lze dosáhnout záchytu největšího množství LSC hodnocením buněk exprimujících alespoň jeden z těchto tří markerů. [46]. Dále z našich výsledků vyplynulo, že v průběhu léčby dochází ke snížení exprese jednotlivých markerů [47].

Zajímavé poznatky ohledně povrchových markerů u CML LSC přinesly i studie na úrovni jednotlivých buněk. Ukázaly, že LSC populace v čase dia­gnózy je heterogenní a lze ji dle RNA exprese rozdělit na subpopulace, které korelují s odpovědí na léčbu TKI. Ve všech subpopulacích bylo nalezeno vysoké procento CD26+, IL-1RAP+ a CD25+ LSC. V průběhu léčby ale docházelo k jejich výraznému snížení a ztrátě překrývající se exprese mezi subpopulacemi. Jako populace nejméně senzitivní na imatinib byla ve studii Warfvinge et al. definována Lin-CD34+CD38-/lowCD45RA-cKIT-CD26+. Tato byla navržena jako možný cíl pro terapii [48]. Giustacchini et al. pak popsali, že v blastické fázi jsou kmenové buňky charakterizovány jako Lin-CD34+CD38-CD90-CD45RA+ s diferenciací do lymfoidní progenitorové řady, přičemž tato populace byla již dříve spojená s rozvojem akutní leukemie [49].

ZÁVĚR

Budoucnost léčby CML ideálně spočívá v kompletní eradikaci nemoci na úrovni LSC. Neméně důležité je i jejich sledování, a to pro stanovení minimální zbytkové choroby a možné určování prognózy. Povrchové markery specifické pro LSC tak mohou plnit jak funkci dia­gnostických markerů, tak funkci případných terapeutických cílů. Využití povrchových markerů je výhodné v tom, že jsou díky své pozici na povrchu buňky snadno dostupné pro léčiva a protilátky, a pokud se nachází specificky pouze na LSC, významně snižují poškození ostatních buněčných populací a okolních tkání. V blastické fázi navíc dochází k získání LSC vlastností i u hierarchicky nižších buněk s odlišným imunofenotypovým profilem, což společně s vysokou heterogenitou populací, ve kterých se nacházejí, dále komplikuje možnosti eradikace LSC. Jako nejefektivnější léčebný přístup se tak jeví využití kombinace podávání TKI společně s terapií cílenou na povrchové markery, což je i předmětem několika probíhajících klinických studií. Ty by zároveň měly odpovědět i na otázku, do jaké míry je tato kombinovaná léčba a samotná cílená eradikace leukemických kmenových buněk klinicky dosažitelná, a zda bude mít požadovaný léčebný efekt pro zlepšení přežívání a kvality života pacientů.

PODÍL AUTORŮ NA PŘÍPRAVĚ RUKOPISU

DS – příprava rukopisu

IJ, JM, DŽ, MČ – kritické revidování rukopisu.

ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

PODĚKOVÁNÍ

Tato práce vznikla s podporou grantu MUNI/A/1330/2021, podporou z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. NU22-03-00136 a projektu Národního ústavu pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, ID: LX22NPO5102) – Financováno Evropskou unií – Next Generation EU.

Do redakce doručeno dne: 13. 5. 2022.

Přijato po recenzi dne: 15. 9. 2022.

Mgr. Dagmar Smitalová

IHOK FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: dagmar.smitalova112@gmail.com

Transfuze Hematol Dnes 2023; 29(1): 9–15