Diagnostické možnosti časného zjištění nádorů ledvin, role nádorových markerů při stanovení dalšího postupu

Overview

Incidence karcinomu ledviny celosvětově stoupá. Z urologických nádorů má po karcinomu prostaty a karcinomu močového měchýře třetí nejvyšší mortalitu. Prognózu významně ovlivňuje patologické stadium a biologická povaha nádoru. V souvislosti s pokroky v molekulární genetice a tzv. cílené léčbě karcinomu ledviny dochází k vyvíjení nových biologických markerů, které zejména při stanovení prognózy onemocnění doplňují tradiční klinickopatologické charakteristiky tumoru. Spolehlivé biomarkery by mohly mít důležitý dopad nejen na stanovení prognózy onemocnění a předpověď efektu léčby, ale i na časnou detekci karcinomu ledviny. Článek přináší přehled těchto potenciálních biomarkerů a možností jejich využití.

Klíčová slova:
karcinom ledviny, časná detekce, nádorové markery, prognóza

Karcinom z renálních buněk (RCC – renal cell carcinoma) představuje 2–3 % všech zhoubných nádorů dospělého věku [1]. Je nejčastější solidní lézí ledviny a tvoří až 90 % všech zhoubných nádorů ledvin. Zahrnuje několik subtypů se specifickými histopatologickými a genetickými charakteristikami [2] – konvenční renální karcinom (označovaný i jako světlebuněčný) (70–80 %), papilární renální karcinom (15 %), chromofobní renální karcinom (5 %), karcinom ze sběrných kanálků a me­dulární karcinom (< 3 %) a neklasifikovaný renální karcinom. Již v čase diagnózy má 25–30 % pacientů metastázy a až u 30 % pacientů dochází ke vzniku metastáz po chirurgické léčbě, tradičně 30–40 % pa­cientů s RCC umírá kvůli samotnému nádoru [3]. Pro prognózu pacienta má tedy zjištění nádoru v časném stadiu klíčový význam. Celosvětová standardizovaná incidence (ASR-W) RCC je 4,0/100 000, mortalita 1,6/100 000 [1]. Až na výjimky v podobě některých států lze od 70. let pozorovat postupné zvyšování incidence RCC ročně o 2–3 % jak v rámci Evropy, tak celosvětově [4,5], což lze vysvětlit častěj­ším prováděním ultrazvukového a CT vy­šet­ření břicha pro různé břišní potíže a jiná onemocnění. Tento trend koreluje s vyšším počtem incidentálně zjištěných a lokalizovaných nádorů a se zlepšením pětiletého přežívání pro pacienty v tomto stadiu onemocnění. Od konce 80. a začátku 90. let lze v Evropě pozorovat obecně stabilizaci a snižování mortality na RCC,i když jsou nadále některé státy, kde mortalita stoupá (Chorvatsko, Estonsko, Řecko, Irsko, Slovensko) [6]. ČR je celosvětově na prvním místě z hlediska incidence RCC – v roce 2008 byla standardizovaná incidence 14,89/100 000, standardizovaná mortalita představovala 5,4/100 000 [7].

Studium familiárních syndromů spoje­ných s karcinomem ledviny vedlo k význam­ným pokrokům v pochopení moleku­lární genetiky RCC, byly rozpoznány a charakterizovány tumor supresorové geny a onkogeny podílející se na vzniku jak familiárních, tak sporadických nádorů s přímým a příznivým dopadem na léčbu pacientů v pokročilém stadiu RCC [3]. Neustále přibývající nové molekulární markery, i ty již tradiční, jsou nadále zkoumány s cílem jejich využití v detekci nádorů, při odhadu odpovědi na léčbu, progrese a stanovení další prognózy onemocnění.

SCREENING A ČASNÁ DETEKCE NÁDORŮ LEDVIN

Vzhledem k lokalizaci ledviny v retroperitoneu jsou ve většině případů nádory ledvin asymptomatické a nehmatné až do pokročilého stadia onemocnění. Díky exten­zivní zobrazovací diagnostice je více než 50 % tumorů detekováno náhodně [8], tyto tumory jsou obvykle ohraničené na ledvinu a mají lepší prognózu – pozitivní efekt časné a incidentální diagnostiky RCC byl prokázán v mnoha studiích [3]. Kar­cinom ledviny jako primárně „chirurgická“ diagnóza je tedy atraktivním cílem pro screening, jeho implementace má však několik omezení [9], a to hlavně nízkou incidenci RCC (ASR 12/100 000/rok – uváděn údaj z USA), při které by scree­nin­gový test musel mít prakticky 100% specificitu. I kdyby měl daný test 100% spe­cificitu a senzitivitu, výtěžnost by byla tak nízká, že poměr ceny a efektivity by byl nepříznivý. Dokonce i při selekci pacientů s rizikovými faktory, jako jsou mužské po­hlaví, vyšší věk nebo kouření, je výtěžnost malá, protože relativní riziko spojené s těmito faktory je maximálně dvou- až troj­násobné [10]. Další limitací jsou kli­nicky insignifikantní nádory, které spolu s benigními nádory tvoří 10–20 % všech lézí a jejichž detekce by vedla k nad­by­tečné diagnostice a léčbě [11]. Hod­nocení výsledků screeningu s chemickým vyšet­řením moči k detekci hematurie, sonogra­fickým vyšetřením nebo CT vy­šetřením břicha potvrzuje kontroverzi po­pulačního screeningu RCC. CT screening zachytí větší množství nádorů ohra­ničených na ledvinu a jeho výtěžnost je vyšší (v různých stu­diích udáváno široké rozmezí 23–300 ná­dorů na 100 tis. vyšetřovaných [3]), je však stále považo­vána za relativně nízkou a vzhledem k ceně vyšetření nelze považovat tento screening za efektivní [12].

V současnosti má screening RCC vý­znam u přesně definovaných cílových skupin – pacienti v konečném stadiu one­mocnění ledvin, se získanou polycystózou ledvin, tuberózní sklerózou a familiárními formami RCC (tab. 1).

Kromě incidentálního radiologického vyšetřování není v současné době k dispozici žádná spolehlivá diagnostická metoda pro časnou detekci RCC. Pohled na časnou detekci a screening karcinomu ledviny by mohla změnit právě molekulární diagnostika a detekce biomarkerů RCC v moči a séru.

MOLEKULÁRNÍ MARKERY KARCINOMU LEDVINY

Pochopení molekulárních základů von Hippelovy-Lindauovy nemoci (VHL) snad nejlépe ilustruje velký terapeutický potenciál odhalení molekulárních mechanizmů onkogeneze [13]. VHL jako familiární forma konvenčního karcinomu ledviny (clear cell renal cell carcinoma – CCRCC), který reprezentuje 70–80 % všech renálních karcinomů, je spojena se ztrátou funkce VHL genu, tedy mutací či inaktivací obou jeho alel. Defekt VHL genu byl však prokázán i u přibližně 60 % sporadických CCRCC [14]. Inaktivace VHL genu zatím nebyla prokázána u jiných histologických subtypů RCC, je tedy specifická pro CCRCC. Defekt VHL proteinu vede k akumulaci HIF 1A (hypoxia-inducible factor) a nadměrné expresi proteinů typických pro stav hypoxie, tyto proteiny však současně indukují angiogenezi (VEGF – vascular endo­thelial growth factor, PDGF – plateled-derived growth factor), buněčný růst (TGF- α, TGF-β – transforming growth factor alfa, beta), ovlivňují vychytávání glukózy (GLUT1), acidobazickou rovnováhu (CA IX – karboanhydráza IX) a podporují růst ná­dorových buněk. Působení TGF-α na EGFR (epidermal growth factor receptor) dále stimuluje proliferaci nádorových buněk [15]. Cílená inhibice HIF kaskády se stala doporučenou léčbou metastatického karcinomu ledviny [16]. Jednotlivé součásti HIF kaskády začaly být zkoumány i jako možné prognostické faktory RCC. Po­stupně se spektrum možných prognostic­kých a prediktivních biomarkerů rozšířilo o další skupiny (tab. 2).

Biomarkery HIF kaskády

Hladiny exprese VEGF jsou u různých subtypů RCC rozdílné a korelují s velikostí nádoru a pTNM stadiem [17]. Vysoké hla­diny v tumorózní tkáni jsou negativním prognostickým znakem. Nadměrná exprese VEGF, izoforma A, je popisovaná u CCRCC s agresivním biologickým chováním a hor­ším přežíváním pacientů [18]. Zhoršení prognózy pacientů s vysokými hladinami exprese VEGF a VEGF-R bylo potvrzeno i v dalších studiích [19]. Nezávislým negativním prognostickým faktorem CCRCC je i samotná zvýšená exprese HIF1A [20].

Karboanhydráza IX ovlivňuje za normálních okolností regulaci pH na buněčné úrovni v případě hypoxie. Je exprimována téměř výlučně u světlebuněčného karci­nomu ledviny, velmi vzácně u ostatních subtypů RCC. V normálních tkáních je exprese prokazatelná v žaludeční sliznici, žlučovo­dech a pankreatu – expresi v normálních epiteliálních renálních buňkách blokuje právě VHL protein [3]. Studie analyzující imunohistochemickými metodami prepa­ráty po nefrektomii prokázaly zvýšenou agresivitu tumorů a horší přežívání pa­cientů s CCRCC v případě nízké exprese CA IX [21,22]. Navíc byl prokázán vztah mezi expresí CA IX a odpovědí na imu­no­terapii RCC interleukinem 2 – vysoká exprese CA IX vede k lepšímu efektu léčby [23]. Role CA IX jako nezávislého prognostického faktoru je některými autory zpochybňována [24], jiní prokazují prediktivní význam spíše polymorfizmu jednotlivých nukleotidů CA IX genu [25]. V současné době probíhá 3. fáze mezi­národní klinické studie hodnotící mono­klonální protilátku k CA IX jako adjuvantní léčbu po nefrektomii a její výsledky by mohly roli CA IX u RCC více objasnit [13].

Biomarkery proliferace

Ki-67 je akcepovaným markerem buněčné proliferace. Jeho zvýšená exprese v nádo­rové tkáni CCRCC koreluje s vyšším gra­dingem dle Fuhrmanové a horší prognózou [26]. Dle novějších studií je tento marker použitelný i v predikci rekurence RCC po radikální nefrektomii u pacientů s lokalizovaným nádorem [27]. Spolu s patologic­kým stadiem (pT1 vs ≥ pT2) a přítomností mikrovaskulární invaze je zvýšená exprese Ki-67 považována za nezávislý prognostický faktor – v případě pozitivity jednoho, dvou nebo všech tří těchto faktorů je riziko rekurence 7,1 %, 24 %, resp. 77 % [28]. Ve stejné studii nebyl prokázán nezávislý prognostický význam žádného z dalších studovaných biomarkerů včetně cluste­rinu, HSP27, MMP-2 a MMP-9.

Biomarkery ovlivňující buněčný cyklus a apoptózu

Dysregulace buněčného cyklu je kritickým mechanizmem, který rozhoduje o tom, zda nádorové buňky budou proliferovat, nebo dojde k jejich apoptóze. Nejvíce studo­va­nými proteiny regulujícími buněčný cyklus s možným vlivem na prognózu RCC jsou cyklin D1 a p27 (označován i jako Kip1). p27 je inhibitor cyklinů a cyklin-dependentní kináza. Ztráta exprese p27 je nezávislým prediktorem horšího nádo­rově specific­kého přežívání i přežívání bez recidivy [29].

Zajímavý je vztah mezi expresí p53 a prognózou RCC. Jelikož je p53 známým tumor supresorovým genem, nabízí se předpoklad, že jeho zvýšená exprese bude spojena s lepší prognózou. Překvapivě je však zvýšená exprese spojena s rychlejší progresí onemocnění a kratším přežíváním [30]. Vztah mezi p53 a patogenezí RCC je tedy zřejmě komplexní a zahrnuje různé mechanizmy – důkazem toho je i nález korelace mezi zvýšenou hladinou p21 (proapoptotický cílový protein p53) a lepší prognózou u pacientů s lokalizovaným RCC, ale naopak horším přežíváním u pa­cientů s metastatickým RCC [31].

Intracelulární molekuly, které aktivují programovanou buněčnou smrt, jsou rov­něž použitelné při stanovení prognózy a hodnocení rizika RCC. Absence Bcl-2 a Fas v preparátech po nefrektomii v případě metastatického RCC predikuje lepší odpověď na pooperační imunoterapii [32]. Vztah mezi expresí a metastatickým RCC ve skupině tzv. inhibitorů apoptózy (IAP1, IAP vázaný na X-chromozom, survivin) zatím není uspokojivě objasněn [33].

DNA markery

Profilování genové exprese DNA nádorů ledviny je slibnou metodou. Mikroanalýzou DNA a srovnáním tkáně RCC a benigní tkáně kůry ledviny bylo odhaleno množství genů, které by mohly být použity pro predikci prognózy RCC nezávisle na stadiu tumoru, grade a celkovém stavu – jedná se o stovky genů, ze kterých většina má neznámou funkci [34]. Prognostický vý­znam při hodnocení rizika RCC má tedy spíše globální genetická informace než jednotlivé geny. Další výzkum se orientuje na posttranslační modifikace a vyšetřo­vání stavu metylace různých genových promotorů ovlivňujících tumor supresorové geny [33].

Imunologické biomarkery

RCC je imunogenní tumor a imunoterapie přestavuje standardní systémovou léčbu metastatického RCC. Molekulární faktory, které modulují imunologickou odpověď u RCC, jsou logicky zkoumány jako možné prognostické biomarkery. Jedná se ze­jména o skupinu glykoproteinů B7. B7-H1 je molekula za normálních okolností exprimována makrofágy nebo aktivovanými T-lymfocyty. Zvýšená exprese u karcinomu ledviny blokuje antigen-specifickou funkci T-lymfocytů a je spojená s rychlejší progresí RCC a vyšší nádorově specifickou mortalitou [35]. Blokáda B7-H1 tedy může vést k stimulaci protinádorové imunitní odpovědi [36].

Sérové biomarkery

Na rozdíl od obvykle používané detekce molekulárních markerů v nádorové tkáni pomocí imunohistochemických metod má stanovení biomarkerů v séru výhodu možného využití v diagnostice karcinomu ledviny a jako neinvazivního způsobu jak stanovení prognózy, tak dalšího sledování u pacientů s diagnostikovaným RCC.

Z výše zmíněných biomarkerů je slibné stanovení antigenu CA IX a CA IX mRNA v séru pomocí ELISA, resp. PCR, které by mohlo být užitečné při stanovení prognózy a sledování pacientů s lokalizovaným CCRCC [37]. Autoři navíc navrhují i možné diagnostické využití ELISA stanovení CA IX při vyšetření aspirátu atypických renálních cyst.

Sérum amyloid A (SAA) je hlavním apolipoproteinem HDL. Jedná se o protein akutní fáze produkovaný v játrech, ale i extrahepatálně různými nádory. Při srov­nání sérových hladin u pacientů s lokalizovaným RCC (N0M0), s postižením lymfa­tických uzlin (N1M0), metastatickým RCC (M1) a u zdravých jedinců byla zjiš­těna signifikantní elevace u M1 pacientů, zatímco u pacientů s lokalizovaným ná­dorem a kon­trolní skupinou nebyl zjištěn rozdíl [38]. Hladina SAA signifikantně korelovala s T stadiem a stupněm diferenciace. Dle autorů je tedy SAA vhodným nástrojem pro detekci vzdálených meta­stáz, ale nikoli pro časnou diagnostiku karcinomu ledviny. Zároveň je SAA signifi­kant­ním nezávislým faktorem pro přežívání pacientů s RCC. Prognostický, nikoli dia­gnostický význam SAA byl potvrzen i další studií [39].

C-reaktivní protein (CRP) je reaktant akutní fáze produkovaný primárně v ját­rech jako reakce na elevaci cytokinů, zejména IL-6. I když je v praxi nejvíce využíván jako zánětlivý parametr, je prokázána i jeho prognostická hodnota (předoperační i pooperační elevace) u RCC z hlediska rizika rekurence a vzniku metastáz po nefrektomii [40]. Lepším prediktorem je pooperační hodnota – pa­cienti s přetrvávající elevací CRP, s rizikem proporcionálě zvýšeným podle absolutní hodnoty, by tedy měli být sledováni intenzivněji než ti, u kterých dojde po operaci k normalizaci [41]. Autoři navrhují nové využití CRP jako senzitivního biomarkeru rekurence onemocnění a metastáz.

KLINICKÉ APLIKACE

Pochopení jednotlivých kroků v karcinogenezi CCRCC vedlo k vývoji cílené léčby. V současné době schválenou léčbu meta­statického RCC reprezentují [16]: sora­fenib a sunitinib (inhibitory tyrozinkináz s aktivitou proti VEGFR2, PDGFR, c-KIT, FLT-3), bevacizumab (protilátka proti VEGF), pazopanib (inhibitor VEGFR, PDGFR, c-KIT), temsirolimus a everolimus (m-TOR inhibitory). Jsou zkoumány látky s aktivitou proti EGFR (panitumumab – protilátka proti EGFR, gefitinib a erlotinib – inhibitory EGRF tyrozinkinázové aktivity) a látky cíleně působící na HIF1A a CA IX [13].

Proteomická analýza umožňuje definování biomarkerů vhodných pro využití v diagnostice a stanovení prognózy RCC.

Co nejpřesnější stanovení prognózy u pacientů podstupujících operační odstra­nění maligního nádoru na základě obecně akceptovaného konsenzu je důležité pro schéma pooperačního sledování těchto pacientů a rozhodování o případné adjuvantní léčbě. Obzvláště to platí pro karcinom ledviny s fenotypem vysoce rezistentním ke konvenční nechirurgické léčbě [28]. Lze dohledat vícero nabízených kombinovaných molekulárně-klinicko-patolo­gických prognostických modelů – kombinace CA IX, vimentin, p53, pTNM, ECOG performance status [42], BioScore – panel 3 biomarkerů (B7-H1, survivin, Ki-67) v kombinaci s klinickopatologickými cha­rakteristikami [43] nebo kombinace patologického stadia, mikrovaskulární invaze a Ki-67 [28]. Jejich možné použití a případná revize prediktivního systému RCC vyžaduje další prospektivní studie zmíně­ných biomarkerů a externí validaci navrhovaných prognostických modelů.

Možnost diagnostiky RCC na základě stanovení exkrece definovaných produktů do moči se opírá o předpoklad eliminace látek, které jsou ve zvýšené míře exprimovány v nádorové tkáni. Vyšetřování moči jako potenciálního zdroje biomarkerů RCC není rozšířené – proteomika (analýza proteinů) v moči zatím dostatečně specifický biomarker neodhalila, mnohé studo­vané proteiny nalezené u pacientů s RCC jsou vylučovány i u pacientů s jinými ná­dory nebo ledvinnými onemocněními [44]. Jako slibná se jeví analýza proteinů aquaporin-1 (AQP-1) a adipophylin (ADFP) [45]. Jejich koncentrace je signifikantně zvý­šená u pacientů se světlebuněčným a papilárním RCC ve srovnání s kontrol­ními skupinami pacientů podstupujících operaci jinou než nefrektomii, zdravými dobrovolníky či pacienty s onkocytomem. Hladiny po nefrektomii (na rozdíl od jiných operací) výrazně klesly, což svědčí pro tumorózní původ těchto proteinů a stejné pre- i pooperační hodnoty u pacientů podstupujících jinou operaci vylučují vliv anestezie či samotného chirurgického zákroku. Tyto výsledky je potřeba potvrdit v dalších nezávislých studiích.

Dalším zdrojem potenciálních biomarkerů RCC je tzv. metabolomika, tedy kvalitativní a kvantitativní stanovení metabolitů v moči. Výsledky jsou však zatím spíše zklamáním – stav metabolitů ovlivňuje dieta pacienta, čas odběru vzorku, jsou pozorovány geografické roz­díly a není možné spolehlivě odlišit metabolity u stejného pacienta před odstraněním tumoru a po něm [46] – a zpochybňují metabolomiku jako scree­ningový nástroj dokonce i pro populaci s rizikem vzniku RCC.

ZÁVĚR

Nové informace o komplexních moleku­lárních alteracích, které vedou ke vzniku a progresi karcinomu ledviny, umožňují identifikaci nových diagnostických a prognostických molekulárních markerů a oteví­rají dveře pro experimentální cílenou léčbu tohoto často letálního karcinomu. K tomu, aby bylo možné implementovat zmíněné biomarkery do běžné klinické praxe, je nutný další výzkum, který by potvrdil přesnější predikci prognózy RCC, než je tomu u běžně používaných klinickopatologických prediktivních modelů a dostatečnou dia­gnostickou hodnotu markerů vhodných pro časnou detekci RCC.

MUDr. Michal Fedorko, FEBU

Urologická klinika FN Brno

Jihlavská 20, 625 00 Brno

misofed@seznam.cz