Neinvazivní prenatální diagnostika z periferní krve matky je prováděna na fragmentované extracelulární fetální DNA o velikosti < 500 bp

Overview

Nejvýznamnějším zdrojem extracelulárních fetálních nukleových kyselin (DNA a RNA) pro účely neinvazivní prenatální diagnostiky jsou apoptotická tělíska trofoblastu. V této práci jsme se zaměřili na studium fragmentace extracelulární DNA přítomné v mateřské cirkulaci u 6 těhotných žen v 16. týdnu gravidity. Fragmentovaná extracelulární DNA byla separována podle délky jednotlivých fragmentů metodou gelové elektroforézy a v jednotlivých sekcích o molekulové hmotnosti 100–300 bp, 300–500 bp, 500–700 bp, 700–900bp, > 900 bp byla stanovena koncentrace fetální a celkové směsné DNA pomocí PCR v reálném čase s využitím specifických primerů a TaqMan sond pro SRY a GLO geny. Fetální DNA byla detekována pouze ve fragmentech o molekulové hmotnosti 100–300 bp a 300–500 bp. Největší koncentrace fetální DNA se vyskytovala v sekci o molekulové hmotnosti 100–300 bp, kde dosáhla hodnot 14,8 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 1,56–83,2). V sekci o molekulové hmotnosti 300–500 bp bylo detekováno menší množství fetální DNA o koncentracích 1,53 kopií/ml periferní krve matky (rozpětí 0–10,8). V sekcích o molekulové hmotnosti 500–700 bp, 700–900 bp a > 900 bp nebyla fetální DNA detekována. Fetální DNA byla ve frakci o molekulové hmotnosti 100–300 bp 4,8násobně zkoncentrována (rozpětí 0krát–16,6krát) ve srovnání s fetální DNA přítomnou v neseparované extracelulární DNA, která se po izolaci z mateřské plazmy používá pro detekci paternálních alel u plodu. Pokud se zaměříme na izolaci DNA o velikosti fragmentů 100–300 bp, získáme koncentrovanější ale nikoliv purifikovanou fetální DNA. Obsah fetální DNA v této frakci činil 1,15 % (rozpětí 0,16–8,0) ve srovnání s neseparovanou extracelulární DNA, kde podíl fetální DNA tvořil pouze 0,29 % (rozpětí 0,06–1,78). Z naší studie je zřejmé, že metoda koncentrace fetální DNA pomocí separace fragmentované extracelulární DNA izolované z mateřské plazmy prostřednictvím gelové elektroforézy není vhodná pro rutinní účely.

Klíčová slova:
apoptóza, extracelulární fetální DNA, fragmentace, kvantitativní PCR v reálném čase, mateřská plazma, SRY gen, GLO gen, trofoblast