Vliv oxidačního a redukčního stresu spermií na některé imunologické vlastnosti ejakulátu

Overview

Cíl: Posuzovali jsme vztah mezi oxidačním a redukčním stresem (ORS), kvalitou intraakrozomálních enzymů (Hs8 a Hs14), spermaglutinačními protilátkami a ostatními parametry spermiogramu v ejakulátu mužů z párů se sníženou plodností.

Soubor a metodika: Analyzovali jsme vzorky ejakulátu 112 mužů (25–50 let; průměr 35,5 let). Hodnotili jsme základní parametry spermiogramu podle manuálu Světové zdravotnické organizace, dále přítomnost antispermatozoidálních protilátek (FertiPro –⁠ přímá smíšená antiglobulinová reakce –⁠ MAR test IgA, IgG), intraakrozomální enzymy imunofluorescenčně pomocí monoklonálních protilátek značených Hs8 a Hs14 a redoxní potenciál spermií.

Výsledky: Zjistili jsme, že u 58,9 % mužů byl ORS v normě, u 24,1 % byl přítomný oxidační a u 17 % redukční stres. Prokázali jsme vysoce signifikantní asociaci mezi ORS statusem a normálním/patologickým spermiogramem. Projevil se velmi silný vztah mezi oxidačním stresem a oligozoospermií. Oxidační stres výrazně koreluje se sníženými hladinami intraakrozomálních enzymů –⁠ pouze 37 % pacientů s oxidačním stresem má normální hodnoty Hs8 i Hs14, zatímco u normálního stresu to je přibližně 80 %. Nejčastější abnormality se vyskytují u pacientů s oligozoospermií (O), kde žádný pacient nemá normální hladiny obou enzymů. Naopak u normozoospermie (N) dominují normální hodnoty –⁠ 41 pacientů pro Hs8 a 39 pacientů pro Hs14. Nebyla nalezena žádná signifikantní asociace mezi ORS statusem a výsledky MAR testů.

Závěr: Oxidační a redukční stres spolu s imunologickými faktory v ejakulátu významně ovlivňují integritu a funkci spermií. V naší laboratoři je ORS součástí diagnostiky imunologicky snížené plodnosti u mužů, neboť ASA (protilátky proti spermiím) mohou poškozovat spermie přímou vazbou i nepřímo aktivací zánětlivé odpovědi a zvýšením produkce reaktivních sloučenin kyslíku. Terapie je pak individualizovaná a kombinována s imunomodulačními, antioxidačními či redoxními přístupy podle zjištěné patologie.

Klíčová slova:

spermie – reaktivní formy kyslíku – oxidační stres – antispermatické protilátky – redukční stres – intraakrozomální enzymy – imunologická infertilita u mužů

Úvod

Oxidační a redukční stres (ORS –⁠ oxidative and reductive stress) představuje klíčový faktor ovlivňující kvalitu spermií a mužskou fertilitu. Rovnováha mezi produkcí reaktivních sloučenin kyslíku (ROS –⁠ reactive oxygen species) a účinností antioxidačních mechanizmů je nezbytná pro udržení strukturální integrity a funkční kapacity spermií. Fyziologické hladiny ROS jsou nezbytné pro procesy jako kapacitace, hyperaktivace či akrozomální reakce, zatímco jejich nadměrná akumulace vede k oxidačnímu poškození lipidových membrán, fragmentaci DNA, mitochondriální dysfunkci a snížené motilitě spermií. Ejakulát se skládá z různých typů zralých a nezralých buněk, kulatých buněk z různých fází spermatogeneze, leukocytů a epiteliálních buněk [1], z nichž jsou leukocyty (zejména neutrofily a makrofágy) a nezralé spermie (s nadbytkem reziduální cytoplazmy) považovány za hlavní endogenní zdroje ROS [2]. Zachovaná reziduální cytoplazma obsahuje metabolické enzymy, jako je glukóza-6-fosfát dehydrogenáza a nikotinamidadenindinukleotid fosfát (NADPH) oxidáza, které přispívají k produkci ROS. Oxidační stres (OS) definovaný jako nerovnováha v hladinách ROS a antioxidantů je uváděn jako jedna z hlavních příčin mužské neplodnosti [3]. Spermie jsou zvláště citlivé na ROS vzhledem k vysokému obsahu polynenasycených mastných kyselin (PUFA –⁠ polyunsaturated fatty acids) a omezené antioxidační ochraně. OS může navíc interferovat s hypotalamickou osou a narušovat sekreci pohlavních hormonů [4,5]. V posledních letech je léčba OS buď cestou snížení ROS, nebo antioxidační terapií považována za atraktivní strategii v léčbě mužské neplodnosti. V každodenní klinické praxi lékaři obvykle předepisují k léčbě případů mužské neplodnosti antioxidační doplňky stravy [6,7]. Vysoké dávky antioxidantů však mohou mít nežádoucí účinky vyplývající z nerovnováhy ve fyziologickém redoxním stavu prostřednictvím jevu zvaného „redukční stres“ nebo „antioxidační paradox“ [4]. Někteří autoři proto doporučují opatrnost při předepisování antioxidantů a individualizaci léčby na základě redoxního stavu pacientů [7].

V posledních letech se do popředí výzkumu dostává též redukční stres charakterizovaný nadměrnou aktivitou antioxidačních mechanizmů, která vede k příliš nízké hladině ROS. Tento často přehlížený stav může rovněž nepříznivě ovlivňovat funkci spermií, jelikož fyziologické množství ROS je nezbytné pro signalizační procesy související s dozráváním a interakcí spermií s ženským reprodukčním traktem. Nerovnováha ve směru redukce tak může vést k selhání akrozomální reakce, mitochondriální dysfunkci spermií, narušené integritě DNA s pravděpodobnými epigenetickými změnami, opožděné kinetice rýhování embrya, dysregulaci fyziologické komunikace mezi spermiemi a imunologickými složkami ejakulátu.

Ejakulát představuje vysoce komplexní biologické prostředí obsahující kromě spermií také plazmatické proteiny, cytokiny a imunitní buňky, které hrají zásadní roli v udržení imunotolerance a ochraně spermií před imunitně zprostředkovaným poškozením. Jak oxidační, tak redukční stres mohou ovlivnit tuto jemně vyváženou síť interakcí a přispět k imunologicky podmíněné infertilitě, například zvýšením prozánětlivé odpovědi či indukcí tvorby antispermatických protilátek.

 

Soubor pacientů a metodika

Zaměřili jsme se na analýzu 112 ejakulátů mužů s průměrným věkem 35,5 ± 5,3 let (rozmezí 25–50 let) v poradně reprodukční imunologie s cílem najít souvislosti mezi redoxním stresem spermií (ORP –⁠ oxidation-reduction potential, na přístroji MiOXYS), výsledky spermiogramu (manuál WHO 2021, 6. vydání), kvalitou intraakrozomálních enzymů (Hs8 a Hs14) imunofluorescencí a výsledky přímé spermaglutinační smíšené antiglobulinové reakce (MAR –⁠ mixed antiglobulin reaction) testu pro IgA a IgG (FertiPro).

Normovaný oxidačně-redukční stres byl rozdělen do tří skupin:

1. redukční stres: ≤ 0,01 mV/10⁶ sperm/ml;

2. normální stres: 0,01–1,34 mV/10⁶ sperm/ml;

3. oxidační stres: ≥ 1,34 mV/10⁶ sperm/ml.

 

Kvalita enzymů Hs8 a Hs14 byla klasifikována do tří skupin:

1. normální počet enzymů: > 80 %;

2. střední počet: 41–79 %;

3. velmi nízký počet: < 40 %.

 

MAR test pro třídy IgA a IgG byl klasifikován do dvou skupin:

1. negativní: ≤ 39 %;

2. pozitivní: ≥ 40 % pohyblivých spermií pokrytých latexovými částicemi.

 

Výsledky

Rozložení ORP statusu: normální stres 66 pacientů (58,9 %), oxidační stres 27 pacientů (24,1 %), redukční stres 19 pacientů (17,0 %) (tab. 1).

 

Statisticky signifikantní vztahy

1. ORP status a parametry spermiogramu

Byla prokázána vysoce signifikantní asociace mezi ORP statusem a normálním/patologickým spermiogramem (c² = 15,105; df = 2; p < 0,001; Cramérovo V = 0,367 –⁠ střední efekt).

• pacienti s normálním ORP měli normální spermiogram v 54,5 % případů;
• u pacientů s oxidačním stresem byl normální spermiogram pouze v 11,1 % případů;
• u redukčního stresu to bylo 36,8 %.

 

2. ORP status a oligozoospermie

Byl prokázán velmi silný vztah mezi oxidačním stresem a oligozoospermií (c² = 25,483; df = 2; p < 0,001; Cramérovo V = 0,477 –⁠ střední až silný efekt).

• 51,9 % pacientů s oxidačním stresem mělo oligozoospermii;
• pouze 6,1 % pacientů s normálním ORP mělo oligozoospermii;
• u redukčního stresu to bylo 21,1 %.

Toto je nejsilnější zjištěný vztah v celém datovém souboru.

 

3. ORP status a koncentrace spermií

Koncentrace spermií vykazuje velmi signifikantní rozdíly mezi ORP skupinami (Kruskal-Wallis H = 44,690; p < 0,001) se střední negativní korelací (Spearmanovo ρ = –0,430; p < 0,001).

• normální stres: medián 64,0 mil/ml (IQR: 45,0–122,8);
• oxidační stres: medián 16,0 mil/ml (IQR: 5,0–24,0);
• redukční stres: medián 36,0 mil/ml (IQR: 27,5–81,0).

Post hoc analýza (Mann-Whitney U-test s Bonferroniho korekcí):

• normální vs. oxidační stres: p < 0,001 (signifikantní);
• oxidační vs. redukční stres: p < 0,001 (signifikantní);
• normální vs. redukční stres: p = 0,049 (nesignifikantní po korekci).

 

4. ORP status a intraakrozomální enzym Hs8

Byla prokázána signifikantní asociace mezi ORS a hladinami Hs8 (c² = 17,241; df = 4; p = 0,002; Cramérovo V = 0,309 –⁠ střední efekt).

• velmi nízké hladiny Hs8 : 33,3 % u oxidačního stresu vs. 3,6 % u normálního stresu;
• normální Hs8 : 94,6 % u normálního stresu vs. 55,6 % u oxidačního stresu;
• u redukčního stresu: 18,8 % velmi nízké Hs8, 81,2 % normální.

 

Analýza intraakrozomálních enzymů podle typu oxidativního stresu

U pacientů s normálním stresem (n = 66):

• Hs8 : 53 pacientů má normální hladiny (80,3 %), 2 very low, 1 low;
• Hs14 : 51 pacientů má normální hladiny (77,3 %), 2 very low, 3 low.

 

U pacientů s oxidačním stresem (n = 27):

• Hs8: pouze 10 pacientů má normální hladiny (37,0 %), 6 very low, 2 low;
• Hs14: pouze 10 pacientů má normální hladiny (37,0 %), 4 very low, 1 low.

 

U pacientů s redukčním stresem (n = 19):

• Hs8 : 13 pacientů má normální hladiny (68,4 %), 3 very low, 0 low;
• Hs14 : 14 pacientů má normální hladiny (73,7 %), 1 very low, 1 low.

 

Oxidační stres výrazně koreluje se sníženými hladinami intraakrozomálních enzymů –⁠ pouze 37 % pacientů s oxidačním stresem má normální hodnoty Hs8 i Hs14, zatímco u normálního stresu to je přibližně 80 %.

 

Analýza intraakrozomálních enzymů podle parametrů spermiogramu

Nejčastější abnormality se vyskytují u pacientů s oligozoospermií, z nichž žádný pacient nemá normální hladiny obou enzymů. Naopak u normozoospermie dominují normální hodnoty (41 pacientů pro Hs8 a 39 pacientů pro Hs14).

Normální stres: pacienti s normozoospermií mají výrazně nejvyšší počet normálních hodnot obou enzymů (Hs8, Hs14).

Oxidační stres: výskyt hladin (low/very low) intraakrozomálních enzymů Hs8 i Hs14 dramaticky stoupá především u pacientů s patologickými spermiogramovými nálezy (O, OA a OAT). Nejnižší hladiny (very low) enzymů Hs8 a Hs14 pozorujeme prakticky pouze u těchto stresovaných skupin, zejména v kombinaci s oligozoospermií.

Redukční stres: u pacientů s redukčním stresem zůstávají hladiny enzymů poměrně příznivé, opět s převahou normálních hodnot hlavně u normozoospermií.

Trend: nejvyšší riziko nízkých hladin enzymů je jasně spojeno s oxidačním stresem, a to zejména u skupiny O, OA a OAT. Normozoospermie vykazuje jasně vyšší podíl normálních hladin enzymů napříč všemi typy stresu oproti ostatním parametrům. Nebyl nalezen výrazný trend abnormalit u redukčního stresu.

 

Statisticky nesignifikantní vztahy

 

5. ORS status a věk

Nebyla prokázána žádná souvislost mezi věkem pacienta a ORS statusem (Kruskal-Wallis H = 0,057; p = 0,972; Spearmanovo ρ = –0,022).

Průměrný věk byl velmi podobný napříč skupinami:

• normální stres: 35,4 ± 5,2 let;
• oxidační stres: 35,6 ± 6,1 let;
• redukční stres: 35,7 ± 4,4 let.

 

6. ORS status a MAR testy (IgA a IgG)

Nebyla nalezena žádná signifikantní asociace mezi ORS statusem a výsledky MAR testů (graf 1):

• MAR IgA: c² = 0,463; p = 0,793;
• MAR IgG: c² = 0,999; p = 0,607.

Pozitivita MAR testů byla podobná napříč všemi ORP skupinami.

Diferenciální exprese IgA vs IgG: pozorovaný průměrný poměr 2,77 : 1.

 

Diskuze

V kontextu mužského reprodukčního zdraví je oxidační stres dobře popsanou příčinou dysfunkce spermií. Nadměrná produkce ROS poškozuje membránu spermií, proteiny a DNA, což zhoršuje pohyblivost a životaschopnost spermií a schopnost oplodnit vajíčko [8]. Oxidační stres je spojen s fragmentací DNA, která je spojována s vyšším výskytem neplodnosti, špatnými výsledky těhotenství a zvýšeným rizikem genetických abnormalit u potomků [9,10]. Význam oxidačního stresu u mužské neplodnosti nespočívá pouze v jeho přímém dopadu na kvalitu spermií, ale také v jeho potenciálu vyvolat dlouhodobé reprodukční a genetické následky.

Jednou z klíčových funkcí ROS je jejich podíl na kapacitaci spermií, tedy biochemickém procesu, který umožňuje spermiím získat fertilizační schopnost. Kapacitace představuje nezbytný předpoklad pro vznik hyperaktivace –⁠ charakteristického typu intenzivní motility, jež je nutná pro průnik ženským reprodukčním traktem a následné oplodnění oocytu. ROS hrají také zásadní roli v regulaci motility spermií. Pohyblivost je vysoce energeticky náročný proces vyžadující koordinovanou aktivaci několika signálních drah, zejména těch závislých na toku vápníkových iontů regulujících činnost bičíku. ROS modulují tyto procesy a umožňují, aby spermie udržely motilitu dostatečně dlouhou dobu k dosažení oocytu. Rovnováha mezi koncentrací ROS a pohyblivostí spermií je proto nezbytná pro úspěšnou fertilizaci. Fyziologické hladiny ROS jsou rovněž klíčové pro spuštění akrozomální reakce, při níž dochází k uvolnění enzymů nezbytných pro penetraci zona pellucida, ochranné vrstvy obklopující oocyt. Bez přítomnosti ROS by akrozomální reakce nebyla iniciována, a spermie by tak nebyly schopny oplodnit vajíčko.

Za fyziologických podmínek je zřejmá pozitivní úloha ROS v reprodukční funkci spermií. Jejich vysoká reaktivita však současně znamená, že i mírné zvýšení jejich koncentrace může vést k poškození spermií. Z toho důvodu je zásadní existence přesně regulované rovnováhy mezi produkcí ROS a antioxidační obranou. Spermie jakožto vysoce specializované buňky vykazují mimořádnou citlivost vůči oxidačnímu stresu, a to vzhledem k jejich unikátní morfologii i funkci.

 

Antioxidační obranné mechanizmy

Antioxidační obranné mechanizmy organizmu představují zásadní ochranný prvek proti škodlivým účinkům nadměrné tvorby ROS. Tyto mechanizmy zahrnují jednak enzymatické antioxidanty, jako je superoxiddismutáza (SOD), kataláza a glutathionperoxidáza, jednak neenzymatické antioxidanty, mezi něž patří například vitaminy C a E, glutathion či albumin [11]. Enzymatické antioxidanty eliminují ROS prostřednictvím jejich přeměny na méně reaktivní formy [12]. Neenzymatické antioxidanty naopak působí jako tzv. scavengery, tedy lapače volných radikálů, které neutralizují ROS dříve, než mohou poškodit buněčné struktury.

V mužském reprodukčním systému hraje významnou roli semenná plazma bohatá na neenzymatické antioxidanty, které poskytují ochranu spermiím před oxidačním poškozením. Tyto extracelulární faktory působí synergicky s intracelulárními enzymatickými systémy, čímž udržují jemnou rovnováhu mezi ROS a antioxidanty.

 

Patologické účinky oxidačního stresu na spermie

Patologické účinky oxidačního stresu na spermie lze rozdělit do tří hlavních kategorií:

• peroxidaci peroxidace lipidů;
• fragmentaci fragmentace DNA;
• oxidaci oxidace proteinů.

 

Každý z těchto mechanizmů přispívá k poklesu kvality spermií a hraje klíčovou roli v rozvoji mužské infertility.

Peroxidace lipidů představuje jeden z nejzávažnějších důsledků oxidačního stresu. Membrány spermií jsou charakteristické vysokým obsahem PUFA, které jsou vysoce náchylné k oxidativnímu poškození [13,14]. Důsledkem peroxidace lipidů je snížení tekutosti membrán, což omezuje pohyblivost spermií, a současně narušení integrity akrozomální membrány nezbytné pro akrozomální reakci a následnou fertilizaci.

Dalším závažným následkem oxidačního stresu je fragmentace DNA. ROS mohou indukovat jak jednovláknové, tak dvouřetězcové zlomy DNA ve spermiích. Tyto zlomy se často nacházejí v oblastech genomu spermií, kde je chromatin volně zabalen, což je činí náchylnějšími k oxidačnímu útoku a zvýšení indukce apoptotických drah [15]. Fragmentace DNA představuje zásadní rizikový faktor mužské infertility, neboť ohrožuje integritu otcovského genomu, snižuje úspěšnost oplodnění a zvyšuje pravděpodobnost vzniku genetických abnormalit u potomků. Na rozdíl od somatických buněk disponují spermie pouze omezenými mechanizmy opravy DNA. Z tohoto důvodu je fragmentace DNA u spermií obzvláště závažná [16].

Využití technologií asistované reprodukce (ART), jako je in vitro fertilizace (IVF) nebo intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI), může obejít přirozené selekční mechanizmy, které by za fyziologických podmínek bránily spermiím s poškozenou DNA v oplodnění oocytu, což by potenciálně vedlo k dlouhodobým následkům pro potomky.

Oxidace proteinů představuje další významný patologický mechanizmus spojený se zvýšenou produkcí ROS. Tyto molekuly mohou modifikovat klíčové proteiny podílející se na motilitě spermií, zejména aktin a tubulin, prostřednictvím tvorby karbonylových skupin. Oxidační modifikace vedou k agregaci a dysfunkci uvedených proteinů, což narušuje strukturální integritu cytoskeletu spermií a negativně ovlivňuje jejich pohyblivost. Kromě toho oxidace proteinů zasahuje i enzymy regulující energetický metabolizmus spermií, což se projevuje snížením dostupnosti adenosintrifosfátu (ATP) nezbytného pro motilitu i fertilizační schopnost. Oxidační poškození povrchových proteinů membrány spermií navíc zhoršuje jejich schopnost rozpoznat a vázat se na oocyt, čímž se dále snižuje pravděpodobnost úspěšného oplodnění.

 

Redukční stres spermií

Klíčové mechanizmy redukčního stresu ve spermiích zahrnují nerovnováhu v redoxním stavu buněk, v němž nadměrná antioxidační aktivita vede k příliš redukovanému prostředí a narušuje normální funkce spermií. Tato redukční nerovnováha může narušit kritické procesy, jako je oprava DNA, mitochondriální funkce a buněčná signalizace. Konkrétně bylo prokázáno, že redukční stres narušuje opravu DNA zprostředkovanou poly-ADP-ribózovou polymerázou, což vede k fragmentaci DNA a poškození struktury chromatinu spermií, vč. defektní protaminové přeměny, která je nezbytná pro zabalení a integritu DNA spermií. Metabolicky ovlivňuje redukční stres mitochondriální operace a narušuje produkci ATP nezbytnou pro pohyblivost a životaschopnost spermií.

Nadměrná přítomnost antioxidantů může potlačit hladiny fyziologických ROS potřebných pro kapacitaci a hyperaktivaci spermií, což vede k funkčním deficitům. Tato delikátní redoxní dynamika zdůrazňuje, že oxidační i redukční stres jsou škodlivé –⁠ zatímco oxidační stres indukuje peroxidaci lipidů, poškození membrán a fragmentaci DNA, redukční stres může vést ke změnám oxidace DNA a mitochondriální dysfunkci prostřednictvím alternativních mechanizmů. Udržování redoxní rovnováhy je proto klíčové pro kvalitu spermií a mužskou plodnost [17–19].

Intraakrozomální enzymy představují heterogenní skupinu proteinů lokalizovaných ve vnitřní části akrozomu spermie, kde hrají klíčové role v procesech fertilizace i energetického metabolizmu spermií. V této studii jsme se zaměřili na charakterizaci dvou specifických intraakrozomálních enzymů identifikovatelných pomocí monoklonálních protilátek Hs8 a Hs14.

Enzym identifikovaný protilátkou Hs8 představuje sperm-specifickou glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (GAPDHS). GAPDHS je klíčová glykolytická izoforma vyskytující se výhradně u spermií, která je lokalizována nejen v akrozomu, ale také ve flagellu spermie [20]. Tento enzym hraje zásadní roli v energetické produkci nezbytné pro motilitu spermií prostřednictvím glykolytické dráhy. Dysfunkce GAPDHS je spojována s poruchami pohyblivosti spermií a může významně ovlivnit mužskou plodnost [21].

Druhý sledovaný protein rozpoznávaný protilátkou Hs14 byl identifikován jako transitional endoplasmic reticulum ATPase (TERA), známý také jako valosin-containing protein (VCP). TERA/VCP je vysoce konzervovaný mechanoenzym ze skupiny AAA+ ATPáz, který se podílí na udržování proteinové homeostázy ve spermii a hraje důležitou roli v regulaci buněčných procesů souvisejících s fertilizací [22].

Současně jsme hodnotili přítomnost antispermatických protilátek (ASA) stanovených přímým spermaglutinačním MAR testem v ejakulátu. MAR test je standardní diagnostickou metodou pro detekci protilátek tříd IgA a IgG navázaných přímo na povrchu spermií. Princip testu spočívá ve směšování čerstvého ejakulátu s latexovými partikulemi potaženými antihumánními protilátkami specifickými pro IgA nebo IgG. Přítomnost ASA se projevuje tvorbou smíšených aglutinátů mezi pohyblivými spermiemi a latexovými partikulemi. Za pozitivní výsledek je považováno pokrytí 40 % a více pohyblivých spermií latexovými partikulemi. Spermaglutinační protilátky představují významný faktor imunologické neplodnosti, která postihuje přibližně 8–10 % neplodných mužů, a mohou negativně ovlivňovat motilitu spermií, jejich schopnost penetrace cervikálním hlenem i interakci se zona pellucida [23].

 

Závěr

Naše výsledky vedou k zaměření na hodnocení obou typů metabolických stresů v seminální plazmě pacientů, protože mají významný vliv na kvalitu spermiogramu (oxidační stres je silně asociován s patologickými nálezy), na koncentraci spermií (oxidační stres výrazně snižuje koncentraci –⁠ medián 16 vs. 64 mil/ml) a hodnoty intraakrozomálních enzymů (např. u intraakrozomálního enzymu Hs8 vede oxidační stres k signifikantně nižším hladinám). Neprokázali jsme však přímou souvislost mezi ORS a seminálními spermaglutinačními protilátkami, což naznačuje, že ORS a imunologické faktory působí nezávisle na kvalitě ejakulátu. Doporučujeme striktně individuální léčbu s ohledem na anamnézu a klinická a laboratorní vyšetření celého infertilního páru s doporučením kontrolních vyšetření s časovým odstupem pro zhodnocení efektu nastavené léčby a případné antioxidační suplementace na spermie i imunologické parametry.