Význam signálnej dráhy MITF pri regulácii proliferácie a invazivity malígneho melanómu

Overview

Východiská:
Malígny melanóm je jedným z najagresívnejších druhov rakoviny. Melanóm primárne vzniká z pigment produkujúcich buniek melanocytov, ktoré sa vyznačujú špecifickými mechanizmami prežívania. Kľúčové postavenie v metabolizme melanómu má transkripčný faktor asociovaný s mikroftalmiou (microphthalmia-associated transcription factor – MITF-M). MITF-M sa zapája do regulácie expresie veľkého počtu génov riadiacich procesy melanogenézy, proliferácie, diferenciácie a prežitia melanocytov. Expresia tohto transkripčného faktora v melanocytoch je aktivovaná niekoľkými signálnymi cestami, pričom blokovanie jeho expresie, alebo funkcie môže znamenať poruchu v regulácii antiapoptotických mechanizmov. MITF-M taktiež ovplyvňuje aktivitu matrixovej metaloproteinázy 14 (matrix metalloproteinase – MMP14), ktorá je zodpovedná za zmenu tvaru melanocytov a za zvýšenie ich pohyblivosti a invazivity. V ľudských melanocytoch s invazívnym fenotypom bola zistená veľmi nízka hladina expresie MITF-M, čo naznačuje že tento transkripčný faktor pôsobí ako supresor metastatického procesu. V rakovinových bunkách s nízkou hladinou expresie cytozolového/nukleárneho β-katenínu, vzniká malé množstvo proteínu MITF-M, ktorý nedokáže inhibovať transkripciu MMP 14. Tento enzým katalyzuje degradáciu laminínu a fibronektínu, čím dochádza k zmene tvaru melanocytov, k zvýšemiu ich pohyblivosti a invazivity.

Ciele:
Táto prehľadová práca popisuje regulačnú dráhu aktivácie MITF-M, jeho zapojenie do proliferácie transformovaných melanocytov ako aj jeho úlohu pri zvyšovaní invazivity malígneho melanómu. Detailné pochopenie mechanizmov fungovania signálnej dráhy MITF-M je vysoko aktuálnou témou a môže pomôcť pri vývoji nových tak diagnostických, ako aj terapeutických aplikácií pri liečbe pacientov s malígnym melanómom.

Kľúčové slová:
transformácia neoplastických buniek – melanóm – transkripčný faktor MITF

Úvod

Malígny melanóm je jedným z najagresívnejších druhov rakoviny. Melanóm primárne vzniká z pigment produkujúcich buniek melanocytov, ktoré sa vyznačujú špecifickými mechanizmami prežívania. Pôsobia hlavne proti viacerým karcinogénnym faktorom, vrátane UV žiarenia a vysoko reaktívnych medziproduktov melanogenézy [1]. Tieto zložité mechanizmy oddiaľujúce bunkovú smrť účinkujú jednak v zdravých melanocytoch ako aj v transformovaných bunkách melanómu. Kľúčové postavenie v metabolizme melanómu má transkripčný faktor asociovaný s mikroftalmiou (microphthalmia associated transcription factor – MITF), ktorý stojí v centre transkripčnej regulácie od embryonálneho vývoja normálnych melanocytov, ich diferenciácie, udržania identity až po prežívanie nielen normálnych, ale aj nádorových melanocytov. V súčasnosti je známych viac ako 40 cieľových génov MITF, ktorých účinky sú častokrát antagonistické [2]. Tento prehľadový článok popisuje regulačnú dráhu aktivácie MITF-M, jeho zapojenie do proliferácie transformovaných melanocytov ako aj jeho úlohu pri zvyšovaní invazivity malígneho melanómu.

Úloha MITF pri vzniku malígneho melanómu

MITF je nukleárny proteín charakteristický pre embryonálny vývoj a postnatálnu životaschopnosť melanocytov. Gén kódujúci tento transkripčný faktor bol lokalizovaný na treťom chromozóme, konkrétne na pozícii 3p14.2-3p14.1 [3]. Proteín MITF existuje celkovo v 12 zostrihových izoformách (označovaných A, B, C, H a M) a každá je exprimovaná zo svojho, tkanivovo špecifického, promótora. Všetky izoformy obsahujú devät exónov a odlišujú sa len prvým exónom, zostrihnutým ku spoločnému druhému exónu. Poloha ostatných exónov je už vo všetkých izoformách rovnaká. Pre melanocyty je špecifická izoforma MITF-M, ktorá je exprimovaná iba v pigmentových a v melanómových bunkách [4]. MITF-M obsahuje viacero špecifických domén (obr. 1) [5]. V centrálnej časti molekuly proteín MITF obsahuje zásaditú oblasť s motívom helix-slučka-helix-leucínový zips (basic helix-loop-helix-leucine zipper – bHLH LZ), ktorá je zodpovedná za väzbu na DNA a dimerizáciu proteínu. MITF-M pozostáva zo 419 aminokyselín a zapája sa do regulácie expresie veľkého počtu génov zapojených do melanogenézy, proliferácie, diferenciácie a prežitia melanocytov.

Priamym cieľom sú gény pre tyrozinázu (tyrosinase – TYR), s tyrozínkinázou asociovaným proteínom 1 (tyrosinase-related protein 1 – TYRP1) a dopachróm tautomerázu (dopachrome tautomerase – DCT), ktoré ovplyvňujú melanogenézu. MITF súčasne ovplyvňuje expresiu génov pre premelanozómový proteín 17 (premelanosome protein 17 – Pmel 17) a osteoartritický proteín 1 (osteoarthritis protein 1 – OA1), čím reguluje transfer melanozómov [6].

Expresia MITF-M v melanocytoch je aktivovaná niekoľkými transkripčnými cestami (napr. cez Pax3 proteín alebo pomocou transkripčného faktora CREB). Tieto transkripčné faktory obsahujú väzbové miesta v blízkosti promótora MITF. Preto sa MITF-M považuje za cieľ pre génovú terapiu, pričom blokovanie expresie alebo funkcie MITF môže znamenať poruchu v regulácii antiapoptotických dráh v melanómových bunkách [7]. Jedným z regulátorov expresie MITF-M je aj receptor pre melanokortín 1 (melanocortin 1 receptor – MC1R). Tento receptor v aktívnom stave vykazuje funkciu G proteínu, ktorý zvyšuje hladinu cyklického adenozínmonofosfátu (cyclic adenosine monophosphate – cAMP). Akumulácia cAMP vedie k aktivácii proteínu viažúceho cAMP odpovedajúceho úseku (cAMP response element-binding protein – CREB), čím sa zvýši expresia MITF-M, čo následne reguluje aktiváciu génov podieľajúcich sa na syntéze melanínu. Plne aktívne alely génu MC1R umožňujú syntézu tmavého pigmentu – eumelanínu, zatiaľ čo alelická varianta s oslabenou aktivitou zodpovedá za tvorbu červeného pigmentu – feomelanínu, ktorý môže mať i fotosenzibilizačné účinky a prispieva k vzniku a vývoju karcinognézy primárneho melanómu [8].

Úloha MITF-M pri regulácii proliferácie

MITF-M taktiež zohráva významnú úlohu pri proliferácii melanocytov [9]. Tento transkripčný faktor je nevyhnutný pre prežívanie a diferenciáciu melanoblastov a melanocytových kmeňových buniek [10]. Prostredníctvom zvýšenej expresie cyklín dependentných inhibítorov p21^Cip1 a p16^INK4a sa MITF-M zapája do regulácie bunkového cyklu [11]. Zníženie aktivity MITF-M vedie k ukončeniu bunkového cyklu v G1 fáze, reorganizácii aktínového cytoskeletu a k zvýšeniu expresie matrixových metaloproteináz, čo vedie k zvýšeniu invazívneho potenciálu melanocytov. MITF-M preto vystupuje ako regulátor proliferácie a diferenciácie normálnych melanocytov, ktorého aktivita môže byť narušená genetickými aj epigenetickými zmenami, čo môže indukovať malígnu transformáciu. Aktivita MITF-M je taktiež regulovaná mikroprostredím nádoru, ako aj vnútrobunkovou hladinou špecifických miRNA, ktoré znižujú množstvo primárneho transkriptu jeho degradáciou [12]. MITF-M tiež pôsobí ako faktor zabraňujúci starnutiu melanocytov (schéma 1) [13]. Pri inhibícii expresie alebo aktivity MITF-M dochádza k predčasnému starnutiu buniek prostredníctvom zvýšenej aktivity p53. Aktivácia p53 je priamym dôsledkom degradačnej kaskády indukovanej poškodením DNA. Vznikajú rôzne mitotické poruchy, čo vedie k nekróze alebo apoptóze [14].

Predčasné starnutie buniek je charakteristické pre premalígne lézie, ale neobjavuje sa pri léziách malígnych. Z uvedených faktov vyplýva, že sledovanie aktivity a expresie inhibítorov bunkového cyklu (p16^INK4a, p21^CIP1 a p27^KIP1) môže pomôcť pri hľadaní nových vhodných prognostických markerov použiteľných aj na rozlíšenie jednotlivých štádií malígneho melanómu [15].

MITF-M a invazivita nádoru

Nádorovo transformované melanocyty patria medzi extrémne pohyblivé a invazívne bunky. Podobne ako pri iných typoch nádorov sa invazivita zvyšuje prostredníctvom remodelácie extracelulárneho matrixu reguláciou proteázovej aktivity matrixových metaloproteináz (matrix metaloproteinases – MMP) alebo zmenou tvaru buniek [16]. Jednu z hlavných úloh pri zvýšení invazivity melanocytov zohráva aktivácia kanonickej Wnt (wingless/integrated) signálnej dráhy, ktorá využíva k prenosu signálu β-katenín, ktorý sa v bunke podieľa na tvorbe adherentných spojov medzi bunkami a ukotvuje aktínové vlákna cytoskeletu. β-katenín je nevyhnutný pre prežívanie a proliferáciu zdravých melanocytov [17]. Regulácia aktivity tohto proteínu závisí na jeho fosforylácii. Ak je β-katenín fosforylovaný cez kinázu glykogén syntázy-3 β (glycogen synthase kinase-3β – GSK-3β) dochádza k jeho ubikvitinácii a následnej proteazomálnej degradácii. Pri aktivácii signálnej dráhy Wnt však nedochádza k fosforylácii, ale k akumulácii β-katenínu v cytozole. Po dosiahnutí hraničnej koncentrácie sa presúva do jadra, kde aktivuje transkripciu špecifických génov, ako napr. MITF-M [18]. V bunkách metastázujúcich melanocytov bola dokázaná Wnt dráhou indukovaná zvýšená hladina transkripcie MITF-M a jeho cieľových génov [19]. Znižovanie expresie β-katenínu v bunkách melanómu zvyšuje ich invazivitu [20]. V ľudských melanocytoch s invazívnym fenotypom bola zistená veľmi nízka hladina expresie MITF-M, čo naznačuje, že tento transkripčný faktor pôsobí ako supresor metastatického procesu [21]. V rakovinových bunkách s nízkou hladinou expresie cytozolového/nukleárneho β-katenínu vzniká malé množstvo proteínu MITF-M, ktorý nedokáže inhibovať transkripciu MMP 14. Tento enzým katalyzuje degradáciu laminínu a fibronektínu, čím dochádza k zmene tvaru melanocytov, k zvýšemiu ich pohyblivosti a invazivity [22]. MITF-M je teda považovaný za jeden z kľúčových komponentov regulácie tvorby a šírenia metastáz malígneho melanómu.

Záver

Doposiaľ publikované štúdie naznačujú, že aktivácia MITF-M predstavuje jeden zo základaných mechanizmov, ktorý integruje špecifické vnútrobunkové signalizácie podieľajúce sa na bunkovej diferenciácii, proliferácii a prežívaní melanocytov. Syntéza enzýmov a štruktúrnych proteínov zapojených do melanogenézy je koordinovaná už na transkripčnej úrovni. Okrem pigmentácie upravuje aktivácia MITF-M aj proliferáciu a invazívnosť zhubných melanocytov, hlavne reguláciou transkripcie génov zapojených do týchto procesov. Zablokovanie transkripčného faktora MITF-M a niektorých jeho aktivátorov má inhibičné účinky na neotransformáciu melanómových buniek. Tento experimentálny prístup je ešte významnejší vzhľadom na vznik rezistencie pri použití súčasných chemických inhibítorov. Preto je štúdium a detailné porozumenie signálnej dráhe MITF-M vysoko aktuálne a môže prispieť k vývoju nových diagnostických postupov využiteľných následne aj pri monitorovaní pacientov s malígnym melanómom.

Práca bola podporená grantovými projekty VEGA 1/0115/14 a VEGA 1/0873/16.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

prof. Ing. Mária Mareková, CSc.

Ústav lekárskej a klinickej biochémie LF UPJŠ v Košiciach

Trieda SNP 1

040 11 Košice

Slovenská Republika

e-mail: maria.marekova@upjs.sk

Obdržané: 4. 12. 2015

Prijaté: 14. 6. 2016