Stanovení mimodřeňové leukemické infiltrace u dětské akutní lymfoblastické leukemie a jeho klinické využití. Přehledný článek a vlastní výsledky

Overview

Minimální reziduální nemoc (MRN) se stala důležitým stratifikačním kritériem u moderních protokolů pro léčbu akutní lymfoblastické leukemie (ALL) dětí i dospělých. Většina výsledků se týká kostní dřeně, studie zkoumající MRN mimo kostní dřeň jsou poměrně vzácné. Podle dosavadních prací MRN v periferní krvi u dětské ALL velmi dobře koreluje s MRN v kostní dřeni v případě T-ALL, u B-prekurzorové ALL je korelace horší a ve většině případů je zde MRN více než o jeden řád nižší než v kostní dřeni. Přesto mají hladiny MRN v periferní krvi prokazatelný prognostický význam v průběhu iniciální léčby dětské ALL, jak jsme prokázali pro den 15 na protokolu ALL IC-BFM 2002. Zatím neexistuje dostatek informací o přínosu vyšetřování mozkomíšního moku pomocí PCR a průtokové cytometrie u pacientů při iniciální diagnóze ALL. Zdá se, že průtoková cytometrie zachytí podstatně více pozitivních výsledků než klasická mikroskopie. PCR i průtoková cytometrie jsou vhodné pro vyšetření leukemického postižení v okamžiku relapsu v CNS, v průběhu léčby relapsu je výpovědní hodnota opět sporná kvůli nedostatečné kvalitě izolované DNA v případě PCR a kvůli rychlé degradaci vzorku při transportu v případě průtokové cytometrie. Jednoznačný přínos PCR je ve stanovení současného postižení kostní dřeně v okamžiku izolovaného extramedulárního relapsu, které zhoršuje prognózu pacienta.

Klíčová slova:
akutní lymfoblastická leukemie (ALL), minimální reziduální nemoc (MRN), periferní krev, extramedulární relaps

Úvod

Současné protokoly pro léčbu akutní lymfoblastické leukemie (ALL) dětí i dospělých stále více začleňují do své rizikové stratifikace sledování minimální reziduální nemoci (MRN). Většina vyspělých zemí prokázala signifikantní vliv MRN na prognózu pacientů (1–8).

Děti s ALL jsou v České republice v současnosti léčeny podle protokolu AIEOP-BFM ALL 2009, jehož riziková stratifikace je založena na kombinaci hodnot MRN v kostní dřeni (KD) měřených ve dni 33 a v týdnu 12 léčby pomocí PCR a na MRN v KD ve dni 15 měřené pomocí průtokové cytometrie. Dospělí pacienti s ALL jsou léčeni podle protokolu GMALL, který pacienty ve skupině standardního rizika stratifikuje podle MRN v KD během prvního roku léčby. ALL je primárně onemocněním kostní dřeně, většina studií tedy používá logicky KD jako hlavní materiál, i když odběry periferní krve (PK) by znamenaly menší zátěž pro pacienty. V tomto článku chceme shrnout poznatky z literatury a naše vlastní zkušenosti s monitorováním MRN v mimodřeňových kompartmentech, především v PK a v mozkomíšním moku (CSF).

Metody

Molekulární genetika: Kvantifikace klonálně-specifických přestaveb genů pro imunoglobuliny (Ig) a T-buněčné receptory (TCR)

V současnosti nejvíce standardizovanou metodikou pro sledování MRN je detekce klonálně-specifických přestaveb genů pro Ig/TCR (9–11). Metoda je založena na iniciálním vyšetření spektra přestaveb Ig/TCR, pro které je daný vzorek klonální, sekvenování jejich unikátních V-(D)-J přechodů, navržení specifických primerů a optimalizaci kvantitativní PCR tak, aby byl pro každého pacienta získán nejméně jeden systém pro detekci MRN s minimální citlivostí 10^-4. Tento postup je náročný metodicky, časově i finančně, a i při dodržování všech pravidel pro interpretaci výsledků přináší nebezpečí falešné pozitivity u vzorků s regenerací kostní dřeně (12). V současnosti se však jedná o jedinou mezinárodně standardizovanou metodu, která je univerzálně použitelná pro většinu pacientů s malignitami z lymfoidní řady.

Průtoková cytometrie

Kombinace monoklonálních protilátek jsou rozvrženy do tří zkumavek:

Zkumavka 1: CD58-FITC (klon AICD58)/xxPE/CD10-ECD (klon ALB1; xx=aberantně exprimovaný antigen)/CD45 PerCP (klon 2D1)/CD19-APC (klon J4.119)/CD34-PC7 (klon LIQ)/CD38-A700 (klon HIT2)/CD20-PB (klon 2H7). Jako znak xxPE používáme CD66c nebo CD33, NG2 podle exprese v diagnóze. Tyto aberantně exprimované antigeny mohou pomoci lépe identifikovat reziduální leukemickou populaci.

Zkumavka 2: CD20-FITC (klon 2H7)/CD10-PE (klon SS2/36)/CD45 PerCP (klon 2D1)/CD34-PC7 (klon LIQ)/CD19-APC (klon J4.119)/ CD38-A700 (klon HIT2)/Syto 41.

Zkumavka 3: Syto16/CD19-PE (klon SJ25C)/CD45 PerCP (klon 2D1)/CD71-A700 (MEM-75)/DAPI.

Měření provádíme na dvou průtokových cytometrech: DAKO CYAN, který je vybaven 3 lasery o vlnové délce 405 nm, 488 nm a 642 nm, a BD LSR II, který je vybaven lasery o vlnové délce 405 nm, 488 nm a 633 nm. Analýzu provádíme v software FlowJo 9.2 (TreeStar, Oregon, USA). Prvním krokem je výběr CD19poz buněk s nižší hodnou granularity (parametr side scatter – SSC) než mají granulocyty. V případě nízké exprese antigenu CD19 vybíráme buňky pomocí parametru CD19 a CD10 nebo CD34 nebo CD45. V další fázi vybíráme atypické buňky na jednotlivých dvourozměrných grafech s cílem optimálně oddělit populaci nemaligních B lymfocytů a atypických blastů. Suspektní leukemické buňky by měly tvořit kompaktní populaci v rámci optických parametrů forward scatter (FSC) a SSC. Konečná hodnota MRN je vyjádřena procentem z jaderných buněk definovaných pomocí fluorescenční značky (SYTO-16 nebo SYTO-41 - molekuly schopné vázat DNA i RNA a volně procházet buněčnou membránou). Pro přepočet na jaderné buňky v rámci dvou zkumavek se použije parametr obsažený v obou zkumavkách, zde antigen CD19. Rozmezí kvantifikovatelnosti MRN dosažitelné FC je definováno jako 0,01 %.

Korelace MRN v kostní dřeni a periferní krvi

První studie provedená na 35 párech vzorků KD a PK z průběhu indukční terapie ALL naznačila, že úroveň MRN v PK bude nižší než v KD (zde v průměru 12x) (13). S rozvojem vysoce citlivých technik byly provedeny dvě studie, které shodně prokázaly, že MRN v periferní krvi (PK) dobře koreluje s hladinou ve dřeni u většiny vzorků ALL z prekurzorů T-lymfocytů (T-ALL), zatímco u B-prekurzorové (BCP) ALL je nálož v PK s velkou variabilitou až 1000x nižší (14, 15). To se zdá být logické vzhledem k vývoji B-lymfocytů v KD a T-lymfocytů v thymu. Obě studie obsahovaly velmi malý počet vzorků s MRN měřitelnou v obou kompartmentech a také malé množství vzorků z prvních týdnů léčby, které mají prokazatelný prognostický význam. Na základě těchto studií se přesto od sledování MRN v krvi ustoupilo.

V naší studii (16) jsme vyšetřili 63 párových vzorků KD a PK u 19 pacientů s T-ALL a 431 párových vzorků KD a PK u 103 pacientů s BCP-ALL, a to převážně z časných bodů léčby (diagnóza, den 8, den 15, den 33, týden 12). Obrázek 1A ukazuje, že u pacientů s T-ALL je korelace hladin MRN mezi KD a PK velmi dobrá, zatímco u pacientů s BCP-ALL je situace podobná jako v předcházejících studiích, tedy MRN v PK zhruba o jeden řád nižší než v KD (obr. 1B).

Zdá se, že i v rámci BCP-ALL existují podskupiny s dobrou korelací KD-PK, a to proB ALL a ALL s fúzním genem BCR/ABL (obr. 1B). Malý počet pacientů v těchto podskupinách ale zatím neumožňuje spolehlivou statistickou analýzu.

Na základě těchto a publikovaných výsledků přistupujeme k nahrazení odběrů KD odběry krve teprve v časových bodech, ve kterých je již malá pravděpodobnost následného relapsu, tedy například při každoročních kontrolách déle než 3 roky po transplantaci krvetvorných buněk. Z výše uvedených studií na druhou stranu vyplývá, že u T-ALL již existuje dostatečné opodstatnění pro nahrazení odběrů KD periferní krví i v časnějších bodech léčby. To aplikujeme u části pacientů po transplantaci, ale pro nahrazení stratifikačních odběrů iniciální léčby (den 33, týden 12) dosud neexistuje dostatečné množství dat.

Prognostický význam postižení periferní krve

Jedním z největších počátečních úspěchů skupiny BFM bylo zjištění, že časná odpověď na prednizonovou předfázi (absolutní počet blastů v PK v den 8, tj. po 7 dnech prednizonu a jedné intrathekální dávce metotrexátu), je nejsilnějším prognostickým faktorem. Pacienti, kteří mají v 8. dni léčby v periferní krvi stále více než 1000 blastů na μl (asi 10 % ze všech pacientů), tvoří skupinu s mnohočetnou lékovou rezistencí, tzv. prednisone poor responders (PPR). Šance na přežití bez události (EFS) v této skupině byla na protokolu ALL-BFM 83 při desetiletém sledování 39 % ve srovnání s 66 % ve skupině s dobrou odpovědí na prednizon. Žádný jiný prognostický znak zatím sám o sobě nedokázal definovat tak velkou skupinu pacientů s EFS pod 50 % (17). Díky snadné dostupnosti a reprodukovatelnosti začlenila většina skupin tento znak do své rizikové stratifikace.

Další studie o roli postižení PK v průběhu léčby jsou velmi vzácné. Výše zmíněná studie (14) hodnotila riziko relapsu u 20 pacientů s přítomností MRN v KD na konci indukční léčby (den 46), léčených podle protokolů skupiny St. Jude Children‘s Research Hospital v Memphisu. Zajímavé bylo, že 4/5 pacientů s MRN zachycenou zároveň v PK prodělali relaps ve srovnání s 2/15 pacientů s MRN přítomnou pouze v kostní dřeni (čtyřletá kumulativní incidence relapsu 0,8 ± 0,25 vs. 0,13 ± 0,9; p = 0,007).

V naší studii vyšlo najevo, že hodnocení PK ve dni 15 pomocí PCR pro přestavby Ig/TCR má prognostický význam, podobně jako vyšetřování kostní dřeně v tomto časovém bodě (18). Pacienti s MRN v PK nižší než 10^-4 měli výbornou prognózu se 100% pětiletým přežitím bez relapsu (RFS), zatímco ostatní pacienti měli RFS 64 ± 7 % (p = 0,0003). Hraničně signifikantní pro prognózu byla i hladina MRN v PK ve dni 8 (p = 0,06).

Důležité je, že naše stratifikace založená na MRN v PK ve dni 15 se překrývá se stávajícími rizikovými skupinami BFM protokolu (založeného na MRN v KD ve dni 33 a týdnu 12 léčby) pouze částečně a dokáže v rámci skupiny středního rizika dle BFM identifikovat podskupinu pacientů s nízkou MRN v PK s výbornou prognózou bez jediného relapsu (p = 0,008). Coxova regresní analýza prokázala, že MRN v PK v den 15 přidává další prognostickou informaci ke stávající rizikové stratifikaci založené na MRN v KD ve dni 33 a v týdnu 12.

Prognostický význam postižení centrálního nervového systému a jeho stanovení

Vedle PK je nejčastějším místem mimodřeňové leukemické infiltrace centrální nervový systém (CNS), i když symptomatické postižení CNS má v době diagnózy pouze asi 3 % dětských pacientů (19). Pomocí morfologického hodnocení mozkomíšního moku (CSF) lze ale přítomnost leukemických blastů prokázat u 15–20 % pacientů, z nichž většina postrádá neurologické symptomy (19, 20). Současným trendem je redukce léčby CNS (především radioterapie) za účelem snížení pozdních následků léčby (21). Z tohoto důvodu je velmi důležité přesné definování skutečného postižení CNS. Práce zkoumající prognostický význam postižení CNS ve smyslu CNS1 (bez postižení), CNS2 (< 5 jaderných buněk/μl v CSF a přítomnost blastů po cytocentrifugaci) a CNS3 (zřetelná CNS leukemie) se v některých aspektech rozcházejí. Zatímco u pacientů s CNS3 leukemií studie shodně prokázaly vyšší riziko relapsu s převahou relapsů v KD, údaje o prognostickém významu CNS2 se liší mezi dvěma nejvýznamnějšími studiemi (22, 23). Dalším aspektem diagnostiky postižení CNS je traumatická lumbální punkce, definovaná jako přítomnost erytrocytů ve vzorku CSF. V závislosti na definici je její výskyt podle jednotlivých studií 7–19 % (19, 24, 25). Podle některých studií představuje traumatická lumbální punkce spojená s přítomností blastů pro pacienta vyšší riziko relapsu, pravděpodobně kvůli zanesení leukemických buněk z krve do CNS (24). Moderní metody, tj. analýza přestaveb Ig/TCR a průtoková cytometrie, by mohly přinést přesnější kvantitativní i kvalitativní hodnocení CSF jak v době diagnózy, tak během sanace likvoru při iniciální leukemické infiltraci. Podle nové studie brazilských autorů byla pozitivita MRN v CSF (měřená metodou přestaveb Ig/TCR) v době diagnózy přítomna až u 47 % z celkem 65 vyšetřovaných dětí s ALL a byla spojena s významně horší prognózou, ale pouze při léčbě méně intenzivním ze dvou použitých protokolů. Autoři shrnují, že tito pacienti pravděpodobně profitují z intenzivnější chemoterapie, na přesvědčivé závěry je ale množství pacientů příliš malé (26).

V naší laboratoři jsme pilotně vyšetřili 24 vzorků CSF od pacientů při diagnóze ALL. 16 pacientů bylo mikroskopicky bez přítomnosti CNS postižení (CNS1), 8 pacientů mělo CNS2 status. Pomocí průtokové cytometrie jsme prokázali pozitivitu v CSF u všech pacientů s CNS2 a navíc i u 6 ze 16 pacientů (38 %) s CNS1 postižením. Celkem je tedy procento postižení CNS při diagnóze ALL na tomto malém souboru vyšší u průtokové cytometrie (58 %) než u klasické mikroskopie (33 %). Medián sledování souboru a jeho malá velikost zatím neumožňují vyvodit závěry o skutečném významu tohoto zjištění.

Po cytometrickém vyšetření jsme ze zbylých cca 200 μl CSF izolovali DNA pro stanovení MRN pomocí přestaveb Ig/TCR. V praxi se pro izolaci nejlépe osvědčila přímá izolace pomocí DNA Micro Kitu od firmy QIAGEN. Koncentrace izolované DNA stanovená pomocí kvantifikace genu pro albumin ukázala, že DNA izolovaná z CSF pacientů s CNS1 postižením je signifikantně méně koncentrovaná než DNA od pacientů s CNS2 (p = 0,002, Mann-Whitney). DNA izolovaná z CSF pacientů v okamžiku diagnózy izolovaného nebo kombinovaného relapsu v CNS měla zdaleka nejvyšší koncentraci (obr. 2), zatímco vzorky izolované v průběhu léčby relapsu měly opět nízkou koncentraci. Z těchto výsledků se zdá, že vyšetření pomocí PCR bude mít dostatečnou citlivost pro stanovení leukemické infiltrace při diagnóze relapsu v CNS, ale pro kvantifikaci méně rozsáhlého postižení CNS v diagnóze nebo pro monitorování léčby relapsu v CNS nebude dostatečně spolehlivé.

MRN u extramedulárních relapsů

Mezinárodní studie s účastí Německa, Francie a České republiky zkoumala molekulárně-genetické postižení KD v okamžiku izolovaného extramedulárního relapsu u 64 dětí s ALL (27). Většinou (59 %) se jednalo o relapsy v CNS, dále o testikulární relapsy (33 %) a zbytek tvořily relapsy v lymfatických uzlinách (2x), v ovariu (1x) a v mediastinu (1x). Studie ukázala, že alespoň minimální postižení KD (tj. detekovatelná hladina MRN v KD) je přítomno u 89 % pacientů. Pacienti s relapsem v CNS měli trend k vyššímu postižení KD než pacienti s testikulárním relapsem (MRN ≥ 10^-4 u 80 % vs. 57 % pacientů; p = 0,08). Pacienti s hladinou MRN v KD vyšší než 10^-4 v okamžiku extramedulárního relapsu měli vyšší kumulativní incidenci následných relapsů (0,65 ± 0,01) než pacienti s nízkou nebo negativní hladinou (0,24 ± 0,01; p = 0,01). Tyto výsledky zatím nebyly zohledněny v léčebném protokolu.

Studie o vlivu poklesu reziduální nemoci v CSF na prognózu pacientů s relapsem v CNS dosud chybějí, zřejmě kvůli poměrně nesnadné logistice přepravy a zpracování vzorků. Pomocí průtokové cytometrie a PCR pro přestavby Ig/TCR jsme vyšetřili celkem 21 vzorků CSF od 8 pacientů s kombinovaným nebo izolovaným relapsem v CNS. Systémy Ig/TCR zavedené při iniciální diagnóze ALL jsme použili pro stanovení výše infiltrace CNS v okamžiku CNS relapsu. U 7 z 8 pacientů byla pro prodělení kontrolním genem stanovena hladina postižení CNS přibližně 100 %, u jednoho pacienta došlo v relapsu ke ztrátě přestavby VH4-JH a tím k falešné negativitě. Pacient byl sledován navíc pomocí fúzního genu MLL/ELL, u kterého byla hladina MRN opět 100 %. Ze 13 vzorků z průběhu léčby relapsu bylo 5 pozitivních oběma metodami, 4 pozitivní pomocí PCR, ale negativní pomocí průtokové cytometrie a 4 negativní oběma metodami. Na tomto malém souboru se zdá, že PCR byla citlivější metodou. Významnou roli u průtokové cytometrie hraje doba transportu vzorku. Buňky ve vzorku velmi rychle hynou a po více než 24 hodinách výpovědní hodnota průtokové cytometrie dramaticky klesá, zatímco PCR je při použití DNA poměrně stabilní. Pro definitivní stanovení významu kinetiky MRN v CNS bude třeba provést rozsáhlejší multicentrickou studii, která je v současnosti plánována skupinou BFM.

Závěr

Uvedené výsledky ukazují, že u dětské ALL je prognosticky významná nejen hladina reziduální nemoci v kostní dřeni, ale i rozsah mimodřeňového postižení. Jeho vyšetřování zejména v periferní krvi a CNS pomocí moderních metod – průtokové cytometrie a molekulární genetiky – může přispět k dalšímu zlepšení léčebných výsledků: např. minimální reziduální nemoc v periferní krvi v 15. dni léčby má důležitý prognostický význam, zpřesňuje stávající rizikovou stratifikaci a identifikuje podskupinu pacientů s výbornou prognózou.

Podíl jednotlivých autorů na přípravě práce

E. Froňková a J. Volejníková sepsaly rukopis a provedly měření minimální reziduální nemoci metodami molekulární genetiky a analýzu těchto dat. E. Mejstříková a L. Slámová jsou odpovědné za oblast průtokové cytometrie. O. Hrušák a J. Trka konzultovali a supervidovali uvedené projekty naší skupiny. V. Mihál, J. Štěrba, Y. Jabali, D. Procházková, B. Blažek, J. Hak, Z. Černá a J. Starý zajistili odběry vzorků, management a klinická data pacientů.

Poděkování

Podpořeno grantem IGA NS10472-3.

MUDr. Jana Volejníková

Klinika dětské hematologie a onkologie

2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha

jana.volejnikova@fnmotol.cuni.cz

Doručeno do redakce: 2. 4. 2012

Přijato po recenzi: 3. 7. 2012