Inhalačné podanie monoklonálnych protilátok: výzvy, obmedzenia a moderné formulačné stratégie

Overview

Biologické liečivá, najmä monoklonálne protilátky, predstavujú kľúčovú terapeutickú skupinu modernej farmakoterapie v liečbe autoimunitných, zápalových, onkologických a zriedkavých ochorení. Napriek ich vysokej účinnosti a špecificite je ich klinické využitie limitované prevažne parenterálnym podaním, čo môže negatívne ovplyvňovať komfort pacienta a dlhodobú adherenciu k liečbe. Inhalačná cesta podania sa v posledných rokoch javí ako sľubná, neinvazívna alternatíva, najmä pri ochoreniach dýchacieho systému. Je tomu tak vďaka veľkej absorpčnej ploche pľúc, bohatej vaskularizácii a možnosti dosiahnuť vysoké lokálne koncentrácie liečiva pri minimalizácii systémových nežiaducich účinkov.

Prehľadová práca sumarizuje a kriticky hodnotí aktuálne poznatky a trendy v oblasti inhalačne aplikovaných monoklonálnych protilátok. Text sa zameriava na špecifiká fyziológie pľúcneho systému, anatomické, fyziologické a imunologické bariéry ovplyvňujúce depozíciu, stabilitu a absorpciu biologických liečiv. Osobitá pozornosť je venovaná pokročilým formulačným stratégiám zameraným na zlepšenie pľúcnej retencie a systémovej biologickej dostupnosti proteínových liečiv. Inhalačné podanie biologík môže v budúcnosti významne rozšíriť terapeutické možnosti monoklonálnych protilátok a prispieť k efektívnejšej a cielenej liečbe.

Klíčová slova:

monoklonálne protilátky – pľúca; inhalačné podanie – formulácie

Úvod

Biologické liečivá predstavujú jednu z najdynamickejšie sa rozvíjajúcich oblastí modernej farmakoterapie. Ich vysoká špecificita, účinnosť a schopnosť cielene zasahovať do patofyziologických procesov viedli k výraznému rozšíreniu ich klinického využitia pri liečbe autoimunitných, zápalových, onkologických a zriedkavých ochorení. Napriek nesporným terapeutickým prínosom sú biofarmaceutiká, najmä monoklonálne protilátky (mAbs), v súčasnosti takmer výlučne viazané na parenterálne aplikačné cesty, čo môže predstavovať významné obmedzenie z hľadiska komfortu pacienta, dostupnosti liečby a dlhodobej adherencie.

Inhalačné podanie liečiv sa v posledných rokoch dostáva do popredia ako atraktívna alternatíva k tradičným aplikačným cestám, predovšetkým pri ochoreniach dýchacieho systému. Pľúca disponujú veľkou absorpčnou plochou, bohatou vaskularizáciou a relatívne nízkou enzymatickou aktivitou v porovnaní s gastrointestinálnym traktom, čo vytvára priaznivé podmienky pre lokálne aj systémové pôsobenie terapeutických molekúl. Napriek týmto výhodám je pľúcne podanie biologických liečiv spojené s množstvom fyziologických, imunologických a technologických výziev, ktoré si vyžadujú pokročilé formulačné prístupy.

Príslušný prehľadový článok sumarizuje a hodnotí aktuálne trendy v oblasti inhalačne aplikovaných monoklonálnych protilátok, pričom sa zameriava na špecifiká vyplývajúce z fyziológie dýchacieho traktu a na možnosti ovplyvnenia ich lokálneho alebo systémového pôsobenia.

Rešerš odbornej literatúry bola vykonaná v databázach PubMed, Scopus a Web of Science. Vyhľadávanie zahŕňalo publikácie vydané v období rokov 2002–2026. Použité boli nasledujúce kľúčové slová a ich kombinácie: „pulmonary drug delivery, monoclonal antibodies, respiratory system, protein therapeutics, absorption strategies“ s využitím logických operátorov AND, OR. Do analýzy boli zahrnuté iba články publikované v anglickom jazyku, ktoré tematicky zodpovedali skúmanej problematike. Vylúčené boli štúdie s nedostatočnou relevanciou alebo bez dostupného plného textu.

Biologické liečivá v modernej farmakoterapii, monoklonálne protilátky

Biologické liečivá, sú liečivá so štruktúrou proteínov alebo nukleových kyselín, ktoré sa najčastejšie vyrábajú technológiou rekombinantnej expresie v živých organizmoch, pričom niektoré z nich môžu byť pripravené aj chemickou syntézou. Existuje niekoľko typov biologických liečiv dostupných na trhu, vrátane liečiv na báze protilátok, antikoagulancií, krvných faktorov, kostných morfogenetických proteínov, enzýmov, fúznych proteínov, rastových faktorov, hormónov, interferónov, interleukínov a trombolytík. Najviac rozšírenými a najrýchlejšie expandujúcimi sú predovšetkým proteínové a peptidové biologiká, ktoré si čoraz výraznejšie nachádzajú uplatnenie na farmaceutickom trhu vzhľadom na ich nesporné výhody, medzi ktoré patrí vysoká účinnosť, špecificita a priaznivý bezpečnostný profil (1). Trh s biologickými liekmi sa v posledných rokoch dynamicky rozvíja, pričom vykazuje medziročný rast približne 20 %, čo výrazne prevyšuje celkový rast farmaceutického trhu na úrovni 9 % (2).

Monoklonálne protilátky predstavujú z medicínskeho hľadiska významný nástroj na liečbu širokého spektra ochorení. Stali sa jednou z dominantných terapeutických modalít s a viac ako 1 500 mAbs vo fáze klinického skúšania. Na základe verejne dostupných údajov bolo v roku 2025 celkovo schválených 19 terapeutických protilátok aspoň v jednej krajine alebo regióne. Od roku 2010 vzrástla vývojová línia schválených monoklonálnych protilátok z čísla 26 na viac ako 200 (3).

Protilátky majú charakter proteínov, pričom sa v ľudskom tele exprimujú v 5 rozličných izotypoch označovaných ako imunoglobulíny, a to konkrétne IgG (zastúpenie spomedzi všetkých protilátok ~80 %), IgA (~ 10 %), IgM (5 %), IgE a IgD (< 1%) (4). Spomedzi nich sa na terapeutické účely najčastejšie využíva izotyp IgG a z neho odvodené fragmenty, predovšetkým ľudský IgG1 a IgG4. Molekula ľudského IgG má charakter globulárneho glykoproteínu, ktorého molekulová hmotnosť (MW) je približne 150 kDa. Pozostáva z dvoch ťažkých a dvoch ľahkých polypeptidových reťazcov, ktoré sú navzájom spojené kovalentnými disulfidovými väzbami (Obr. 1). N-terminálna variabilná doména (V_H) ťažkého reťazca sprostredkováva interakciu s antigénom, zatiaľ čo konštantné domény (C_H1, C_H2, C_H3) zabezpečujú štruktúrnu funkciu a imunitné efektorové mechanizmy, vrátane protilátkami sprostredkovanej bunkovej cytotoxicity a komplementom podmienenej cytotoxicity. Ľahký reťazec protilátky pozostáva z variabilnej domény (V_L), ktorá sprostredkúva väzbu antigénu a jednej konštantnej domény (C_L, κ alebo λ), ktorá tvorí disulfidovú väzbu s ťažkým reťazcom (doména C_H1).

Monoklonálne protilátky vykazujú relatívne pomalý prienik do tkanív a dlhý polčas degradácie v sére, pohybujúci sa v rozpätí dní a týždňov. Je to v dôsledku ich veľkej MW presahujúcej prah renálnej filtrácie a recyklácie prostredníctvom neonatálneho Fc receptora v cievnom endoteli, čo umožňuje udržiavanie terapeutických koncentrácií u pacientov počas dlhšieho obdobia bez potreby opakovaného podania (4). Limitujúcimi faktormi v prípade mAbs je ich vysoká MW a polarita, ktoré priamo zodpovedajú za obmedzenú mukóznu permeabilitu cez epitel, čoho dôsledkom je preferencia parenterálneho alebo subkutánneho podania v klinickej praxi. V súčasnosti sú však vyvíjané aktivity smerujúce k hľadaniu možností iného spôsobu aplikácie mAbs, pričom za jednu zo sľubných alternatív sa považuje inhalačné (pľúcne) podanie.

Inhalačná cesta podania biologík

Chronická obštrukčná choroba pľúc (CHOCHP) postihuje takmer 400 miliónov ľudí na celom svete a zostáva treťou najčastejšou príčinou úmrtí globálne. Pacienti liečení štandardnou liečbou aj naďalej zažívajú exacerbácie, čo zvyšuje riziko kardiopulmonálnych príhod a mortality.

Tozorakimab, vyvíjaný spoločnosťou AstraZeneca, predstavuje potenciálne prvú mAb vo svojej triede, ktorá inhibuje signalizáciu redukovanej aj oxidovanej formy interleukínu-33 (IL-33), čím ponúka možnosť súčasne redukovať zápal a narušiť cyklus porúch hlienovej regulácie, ktoré prispievajú k progresii CHOCHP.

Pozitívne predbežné výsledky z klinických štúdií III. fázy OBERON a TITANIA u pacientov s CHOCHP naznačujú, že tozorakimab dosiahol v porovnaní s placebom štatisticky významné a klinicky relevantné zníženie stredne ťažkých a ťažkých exacerbácií CHOCHP. Tieto zistenia sa týkali nielen populácie bývalých fajčiarov, ale aj celkovej populácie, ktorá zahŕňala bývalých aj súčasných fajčiarov, pričom pacienti pokrývali široké spektrum hodnôt eozinofilov v krvi aj všetky stupne závažnosti poruchy pľúcnych funkcií. Podľa dostupných údajov bol tozorakimab vo všeobecnosti dobre tolerovaný a vykazoval priaznivý bezpečnostný profil.

Ďalšie klinické štúdie III. fázy (PROSPERO a MIRANDA) prebiehajú v súčasnosti a tozorakimab sa zároveň skúma aj pri ťažkých vírusových infekciách dolných dýchacích ciest a pri astme (5). Tieto výsledky zároveň poukazujú na rastúci význam vývoja cielene podávaných biologických liečiv, vrátane inhalačných foriem, ktoré môžu umožniť efektívnejšie a lokálne špecifické ovplyvnenie zápalových procesov v dýchacích cestách.

Inhalačné podanie predstavuje neinvazívnu aplikačnú cestu a v prípade biologických liečiv aj potenciálne zníženie aplikovanej dávky, pričom je možné dosiahnuť lokálny aj systémový účinok. Inhalačná cesta podania terapeutických biologík môže ponúknuť mimoriadne výhody najmä pri respiračných ochoreniach. Predpokladá sa rýchlejší nástup účinku (v priebehu minút až hodín) v porovnaní s inými cestami podania (dni), pretože koncentrácia biomolekuly v mieste účinku vo všeobecnosti determinuje jej potenciu (6). Systémové podanie mAbs v takýchto prípadoch zacielenia terapie vedie k veľmi nízkym koncentráciám v pľúcnom tkanive a zároveň vystavuje zvyšok organizmu potenciálnym nežiaducim účinkom (7). Ako vhodný príklad možno uviesť mAb bevacizumab (liečivo Avastin), ktorá inhibuje angiogenézu naviazaním na vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF). Používa sa pri liečbe rôznych typov nádorových ochorení, avšak jej systémové podanie je spojené s vedľajšími účinkami, ako sú hypertenzia, krvácanie, trombózy, spomalené hojenie rán či poškodenie obličiek (8). Inhalácia preto predstavuje atraktívnu, lokálnu a neinvazívnu alternatívu k systémovému podaniu takýchto liečiv. Hodnotenie účinnosti aerosólového podania protinádorových mAbs pri myších modeloch s indukovanou rakovinou pľúc preukázalo, že mAbs aplikované inhalačnou cestou dosahujú v nádorovom tkanive dvojnásobné koncentrácie v porovnaní s intravenóznym podaním a sú farmakologicky účinné pri zastavení rastu nádorových buniek (9). Farmakokinetické analýzy rozličných mAbs podaných inhalačne u myší a primátov zároveň preukázali minimálny prestup z pľúc do krvného obehu a akumuláciu protilátok v pľúcnom tkanive (10).

Omeier a kol. vo svojej publikácii poskytujú systematický prehľad nežiaducich účinkov liečiv na báze monoklonálnych protilátok, pričom ich klasifikujú podľa závažnosti (mierne, stredné, závažné) a zároveň poukazuje na zásadný význam farmakovigilancie pri ich klinickom použití, čím zdôrazňuje potrebu kontinuálneho monitorovania bezpečnostného profilu týchto liečiv v klinickej praxi (11).

Výhodou inhalačného podania je aj veľká povrchová plocha pľúc a relatívne dobrá priepustnosť pľúcneho tkaniva. Napriek týmto výhodám, existujú anatomické, fyziologické a imunologické prekážky ovplyvňujúce systémovú absorpciu inhalovaných proteínov a peptidov, medzi ktoré patria vysoko rozvetvená štruktúra dýchacích ciest, mukociliárny klírens, fagocytóza alveolárnymi makrofágmi, enzymatický metabolizmus, adsorpcia na pľúcny surfaktant a obmedzená permeabilita epitelu. Aktuálne sa preto výskum intenzívne zameriava na pokročilé formulačné stratégie a technológie s cieľom zlepšiť pľúcnu depozíciu a následnú absorpciu peptidov a proteínov. Okrem biologických bariér však môže počas výroby, podávania a skladovania biologík často dochádzať aj k ich fyzikálnej a chemickej degradácii.

Fyziológia pľúc a inhalačne podávané liečivá

Respiračný systém (Obr. 2A) je zodpovedný za fyziologický proces výmeny dýchacích plynov (kyslík a oxid uhličitý) medzi vnútorným a vonkajším prostredím. Dýchacie cesty sa delia na dve hlavné anatomické časti –⁠ horné (nosová dutina, hltan a hrtan) a dolné dýchacie cesty (trachea, bronchy, bronchioly, alveoly), pričom do procesu dýchania sú aktívne zapojené dýchacie svaly a bránica. Samotné pľúca sa skladajú z parenchýmu a interstícia. Parenchým tvoria bronchy, bronchioly a alveoly, zatiaľ čo interstícium pozostáva zo spojivového tkaniva, krvných ciev, lymfatických ciev, uzlín a nervov (12). Priamo na výmene plynov sa podieľajú alveoly (malé, vzduchom naplnené vačky v pľúcach), ktorých celková plocha u dospelého človeka presahuje 70 m², čo robí z pľúc potenciálne atraktívny cieľ podávania liečiva. Je však potrebné skonštatovať, že pľúca sú neustále vystavované rôznym environmentálnym faktorom, vrátane patogénov, toxínov a alergénov, ktoré môžu vyvolávať pľúcne infekcie alebo zápal. Preto si organizmus vyvinul viaceré obranné mechanizmy na úrovni dýchacích ciest založené na fyziologických a imunologických procesoch. Tieto mechanizmy je potrebné vziať do úvahy, pokiaľ chceme využiť inhalačnú cestu podania liečiv.

Vo všeobecnosti inhalované liečivá charakteru malých molekúl (konvenčné liečivá) vstupujú do systémového obehu, pričom tento proces zvyčajne začína tvorbou ich aerosólu, po ktorej nasleduje pľúcna depozícia častíc. Keď sa liečivo dostane do pľúc, najskôr sa dostane do kontaktu s tekutinou vystielajúcou sliznicu dýchacích ciest, ktorá pokrýva a chráni ich povrch. Zloženie danej tekutiny sa líši v závislosti od miesta, v prieduškách pokrýva epitelové bunky vrstva hlienu, zatiaľ čo v alveolách epitel vystiela vrstva surfaktantu (13). Častice vysoko rozpustného liečiva prechádzajú cez vrstvu epitelových buniek pasívnou difúziou, aktívnym transportom alebo transcytózou a následne vstupujú do pľúcneho interstícia alebo systémového obehu (Obr. 2B, C) (14). Rýchlosť a účinnosť difúzie pritom klesá so zvyšujúcou sa hydrofilnosťou a nábojom liečiva, pričom difúzia cez pľúcnu bariéru exponenciálne klesá so zvyšujúcou sa MW (12). Na druhej strane, častice liečiv s nízkou rozpustnosťou podliehajú trom hlavným obranným mechanizmom, a to: a) mukociliárnemu klírensu; b) fagocytóze makrofágmi a c) pôsobeniu alveolárnych surfaktantov. Tieto mechanizmy ovplyvňujú dobu zotrvania liečiva v pľúcach a môžu buď znižovať, alebo zvyšovať ich biologickú dostupnosť, čo napokon ovplyvňuje terapeutické výsledky.

Vysoké koncentrácie nízko molekulových liečiv majú tendenciu viesť k rýchlej systémovej absorpcii z pľúc, čo nemusí predstavovať problém v prípadoch, keď je cieľom systémové podanie. Avšak pri liečivách, ktorých účelom je lokálne pôsobenie v respiračnom trakte to predstavuje výzvu. Jednovrstvová štruktúra alveolárnych buniek a buniek kapilárnej steny tvorí bariéru, ktorá zadržiava veľké molekuly v pľúcach a bráni ich prestupu do systémového obehu. Na základe údajov zo zvieracích modelov vykazujú malé proteíny (6–50 kDa) len strednú mieru absorpcie, pričom v pľúcach sa pozoruje 60–90 % biologická dostupnosť. Proteíny s vysokou MW (~150 kDa) vykazujú zanedbateľnú absorpciu, pričom viac ako 90 % liečiva ostáva lokalizovaného v pľúcach (15). To znamená, že podávanie proteínových liečiv môže byť výhodné v situáciách, keď je terapeutický cieľ lokalizovaný v pľúcach a systémová cirkulácia by mohla viesť k nežiaducim vedľajším účinkom.

V súčasnosti sú však čoraz viac vyvíjané aktivity smerujúce aj k zefektívneniu systémového účinku peptidových a/alebo proteínových liečiv podávaných inhalačnou cestou. Stratégie sú smerované predovšetkým na ovplyvnenie a modifikáciu základných fyziologických a imunologických bariér pľúcneho systému. Jedným z dominantných problémov inhalačne aplikovaných biologík sa môže javiť metabolický aparát periférnej respiračnej zóny disponujúci napr. serínovými a cysteínovými proteázami, aminopeptidázami, metaloproteázami, trypsínom alebo katepsínom, ktoré sú viazané na membránu alebo sú sekretované pľúcnym epitelom a makrofágmi. Degradácia inhalovaných proteínov a peptidov môže nastať po ich depozícii v dýchacích cestách alebo počas transportu cez pľúcny epitel. Miera enzymatickej hydrolýzy závisí od MW liečiva –⁠ krátke polypeptidy s počtom aminokyselín menej ako 30 podliehajú degradácii vo väčšej miere ako proteíny s výraznejšou terciárnou a kvartérnou štruktúrou. Vo všeobecnosti proteíny s MW v rozmedzí 6 –⁠ 50 kDa vykazujú pomerne dobrú odolnosť voči peptidázam a po inhalácii dosahujú uspokojivú biologickú dostupnosť, čo je čiastočne spôsobené tým, že konce ich aminokyselinových reťazcov sú skryté vo vnútri globulárnej štruktúry a nie sú dostupné pre hydrolýzu. Degradácia proteínov prebieha vo väčšine prípadov intracelulárne, v špecializovaných organelách (16).

Výraznejší problém z pohľadu inhalačnej aplikácie biologík zohráva mukociliárny klírens, ktorý predstavuje prvú líniu obrany proti cudzorodým časticiam (17). Cílie spolu s hlienom tvoria dôležité komponenty povrchovo aktívnej vrstvy v priedušnici aj na všetkých úrovniach priedušiek. Mukociliárny klírens funguje na princípe zachytávania častíc v hliene a následnom rytmickom pohybe cílií, ktorý posúva cudzorodé častice smerom do horných dýchacích ciest, kde dochádza k ich vylúčeniu z organizmu (18).

Interakcia medzi mucínmi a proteínovými liečivami je sprostredkovaná najmä nekovalentnými väzbami, vrátane elektrostatických interakcií, vodíkových väzieb a hydrofóbnych interakcií. Vzhľadom na výrazne polyaniónový charakter mucínov dochádza k preferenčnej väzbe katiónových proteínov, čo vedie k ich retencii v hlienovej vrstve a následne k zníženej permeabilite.

Keďže mucínové vlákna nesú negatívny náboj, mukoadhezívne častice sú často navrhované s pozitívnym povrchovým nábojom. Typickým príkladom je chitozán, bežne používaný mukoadhezívny polymér, ktorý sa viaže na povrch častíc prostredníctvom chemickej konjugácie alebo fyzikálnej adsorpcie. Tieto elektrostatické interakcie sú však relatívne slabé a môžu byť oslabené pri vysokej iónovej sile alebo kolísaní pH.

Ďalšou stratégiou je tvorba kovalentných väzieb, napríklad disulfidických mostíkov medzi tiolovými skupinami na povrchu častíc a mucínovými vláknami. Tento prístup spravidla zabezpečuje silnejšiu a stabilnejšiu adhéziu než elektrostatické interakcie, čím predlžuje rezidenčný čas, avšak vyžaduje komplexnejšiu chemickú modifikáciu a môže byť náchylný na štiepenie v redukčnom prostredí.

Napokon, niektoré polyméry, ako napríklad polyakrylová kyselina, algináty a kyselina hyalurónová, adherujú prostredníctvom fyzikálneho prepletenia s mucínovými vláknami a bežne sa používajú ako materiály pre formuláciu mukoadhezívnych častíc. Každá z týchto stratégií má svoje výhody aj obmedzenia a na zvýšenie celkovej mukoadhezívnej účinnosti sa často kombinuje viacero mechanizmov (19).

Ďalším z prirodzených fyziologických mechanizmov brániaci ukladaniu a správnej depozícii inhalačne podaného liečiva je proces fagocytózy sprostredkovaný alveolárnymi makrofágmi (12). Schopnosť fagocytózy alveolárnymi makrofágmi závisí od viacerých faktorov, ktorými sú predovšetkým:

• Chemická štruktúra: polysacharidy, proteíny a peptidy sú imunogénne a majú tendenciu vyvolať imunitnú reakciu v pľúcach, čo môže výrazne znížiť terapeutickú účinnosť daných molekúl (16).
• Veľkosť častíc: častice s veľkosťou 1 –⁠ 6 μm sú ľahko fagocytované makrofágmi, pričom najintenzívnejšia fagocytárna aktivita je pozorovaná pri veľkosti častíc okolo 3 μm (20).
• Tvar častíc: v porovnaní so sférickými časticami majú častice s nepravidelným tvarom väčšiu šancu uniknúť fagocytóze makrofágmi (21).
• Rozpustnosť častíc: rozpustné a hydrofilné častice sa rozpúšťajú rýchlejšie ako dôjde k procesu fagocytózy (21).
• Povrchové vlastnosti častíc: povrchový náboj častíc je dôležitý pre ich stabilitu aj potenciálnu interakciu s makrofágmi. Makrofágy ľahšie fagocytujú častice so záporným nábojom v porovnaní s neutrálnymi časticami (22).

Z hľadiska prirodzenej ochrany prieniku látok rozličného charakteru cez pľúca do systémového obehu zohráva významnú úlohu taktiež pľúcny surfaktant, ktorý je produkovaný a sekretovaný alveolárnymi bunkami typu II (AT2). Pľúcny surfaktant znižuje povrchové napätie v alveolách, čím zabraňuje ich kolapsu počas výdychu a udržiava ich štrukturálnu integritu pre efektívne dýchanie. Surfaktant tvorí 90 % lipidov a 10 % proteínov, ktoré spoločne prispievajú k znižovaniu povrchového napätia na danom rozhraní (23). Najviac zastúpenými lipidmi pľúcneho surfaktantu sú fosfolipidy, z ktorých práve dipalmitoylfosfatidylcholín (DPPC) je najviac dominantný. V chemickej štruktúre pľúcneho surfaktantu sa nachádzajú 4 fenotypy surfaktantových proteínov (SP). SP-A a SP-D sú veľké molekuly hydrofilných glykoproteínov, ktoré napomáhajú prirodzenej fagocytóze makrofágov. SP-B a SP-C sú malé hydrofilné molekuly proteínov, ktoré udržiavajú a regulujú fyziologickú funkciu surfaktantu –⁠ uľahčujú dýchanie, bránia alveolárnemu kolapsu, zabezpečujú stabilitu morfológie alveol, chránia alveolárne epitelové bunky a zúčastňujú sa imunitnej odpovede organizmu (24, 25).

Stratégie na zlepšenie absorpcie inhalovaných biologík

Aktuálne stratégie vedúce k zvýšeniu absorpcie proteínových liečiv sú zamerané na obchádzanie/potlačenie prirodzených fyziologických bariér. Na obrázku 3 je možné vidieť schematicky znázornené mechanizmy, ktorými dokážeme ovplyvniť absorpciu inhalovaného proteínového liečiva. Jedným z takýchto mechanizmov je chemická modifikácia samotného proteínu. Kovalentná väzba polymérov na sulfhydrylové, amino -⁠ alebo karboxylové skupiny bočných reťazcov proteínových molekúl predstavuje efektívnu stratégiu na zníženie vplyvu mukociliárneho klírensu pri inhalačne podávaných biologikách. Takáto modifikácia vedie k zvýšenej retencii liečiva v pľúcnom tkanive a následne k zlepšenej systémovej absorpcii. Okrem toho polymérne konjugáty významne zvyšujú fyzikálno-chemickú a biologickú stabilitu terapeutických proteínov, čo predstavuje dôležitú výhodu z hľadiska ich priemyselnej výroby a skladovania (26). Spomedzi polymérnych konjugátov sú najrozsiahlejšie preskúmané proteíny modifikované polyetylénglykolom (PEG), ktoré v súčasnosti predstavujú etablovaný štandard v danej oblasti. V posledných rokoch sa však do popredia dostávajú aj zwitteriónové polyméry, ktoré sa ukazujú ako mimoriadne perspektívne alternatívy na zvýšenie systémovej absorpcie inhalovaných proteínov a peptidov (27).

PEG-ylácia proteínov

Polyetylénglykol (PEG) pozostávajúci z opakujúcich sa jednotiek etylénglykolu je biokompatibilný, neutrálny a neimunogénny polyéter dostupný v širokom spektre molekulových hmotností. Vďaka svojej flexibilite a vysokej hydratácii je schopný vytvárať stérické prekážky brániace prístupu proteáz, protilátok a opsonínov (28). PEG-ylácia je preto atraktívnou farmaceutickou technológiou, ktorá umožňuje dlhšie zotrvanie proteínov a peptidov v pľúcach, a to v dôsledku zväčšenia molekulovej veľkosti, zvýšenia odolnosti voči proteolytickému štiepeniu a zníženiu fagocytózy makrofágmi (29). Navyše pľúcna administrácia PEG-ylovaných proteínov predstavuje neinvazívnu možnosť pre systémovú absorpciu s predĺženým plazmatickým polčasom, pričom zmenené farmakokinetické správanie (lokálne alebo systémové pôsobenie) úzko súvisí s veľkosťou PEG substituentu (30). Youn a kol. (31) preukázali, že intratracheálne podanie PEG-ylovaných derivátov lososieho kalcitonínu vedie k zvýšeniu systémovej účinnosti in vivo v dôsledku ich vyššej proteolytickej stability a predĺženého cirkulačného polčasu, pričom oba parametre boli závislé od veľkosti PEG (1–5 kDa). Použitie PEG s nízkou MW tak napomáha transportu liečiv z mukóznej vrstvy do vodného pericilárneho tekutého prostredia. PEG-ylácia môže byť efektívna aj z hľadiska obídenia fagocytárneho vychytávania liečiv, čo preukázali vo svojej práci Japiassu a kol. (32), ktorí sa zamerali na nanočasticové systémy typu lipozómov s povrchovou modifikáciou PEG a kyseliny hyalurónovej. PEG-ylácia povrchu lipozómov efektívnym spôsobom bránila procesu opsonizácie.

Hlavná nevýhoda PEG-ylačnej stratégie je spojená s tým, že konjugácia proteínov s PEG môže narušiť pôvodnú biologickú aktivitu. Preto je dôležité zohľadniť špecifickú lokalitu PEG-ylácie, namiesto náhodného naviazania PEG reťazcov. Okrem toho, opakované podávanie PEG-ylovaných proteínov, lipozómov alebo nanočastíc môže vyvolať fenomén zrýchleného klírensu, sprostredkovaný anti-PEG protilátkami, čo môže negatívne ovplyvniť terapeutický účinok biologík pri chronickej liečbe (33).

Zwitteriónové polyméry

Zwitteriónové polyméry (napr. karboxybetaín, sulfobetaín a fosfobetaín) sú špecifické obsahom katiónových aj aniónových skupín na každej monomérnej jednotke pozdĺž polymérneho reťazca (27). Spomedzi týchto látok vykazuje polykarboxybetaín (pCB) schopnosť minimalizovať nešpecifické interakcie s pľúcnym prostredím a zvyšovať absorpciu proteínov do krvného obehu pri zanedbateľnej imunogenicite. Zároveň konjugácia pCB zvyšuje stabilitu proteínov bez negatívneho vplyvu na ich bioaktivitu, a to vďaka jeho štrukturálnej podobnosti s glycínbetaínom, ktorý sa prirodzene vyskytuje v ľudskom organizme. Tsao a kol. (34) preukázali, že organofosfátová hydroláza konjugovaná s pCB (5, 10 a 20 kDa) podaná intratracheálnou instiláciou do pľúc vykazovala zlepšené farmakokinetické vlastnosti a profylaktickú účinnosť proti otrave organofosfátmi.

Kľúčovou vlastnosťou týchto zlúčenín je ich extrémna hydrofilita, vďaka ktorej bránia adsorpcii proteínov, aktivácii imunitného systému a minimalizujú bunkovú adhéziu. Zwitteriónové polyméry predstavujú najperspektívnejšiu alternatívu PEG, ktorý sa zvykne považovať za zlatý štandard pri úprave proteínových liečiv (35). Pri konjugácii proteínu s zwiterriónovým polymérom je proteínové liečivo chránené pred degradáciou a zachováva si biologickú aktivitu. To následne vedie k predĺženiu biologického polčasu, lepšej farmakokinetike a vyššej biologickej dostupnosti.

Inhibítory proteáz

Keďže absorpcia proteínov a peptidov môže byť obmedzená ich enzymatickou degradáciou, inhibítory proteáz predstavujú prístup zameraný na redukciu rozkladu rôznych peptidov a proteínov v mieste absorpcie a následné zvýšenie ich systémovej dostupnosti. Miera zvýšenia absorpcie závisí od enzýmov, ktoré daný inhibítor proteáz dokáže potlačiť, ako aj od citlivosti daného proteínu. Za inhibítory proteáz zlepšujúce stabilitu a pľúcnu absorpciu inhalovaných biologík sú považované napr. aprotinín (inhibítor serínových proteáz), bacitracín (inhibítor aminopeptidáz), bestatín, leupeptín, chymostatín, inhibítory sójového trypsínu a glykocholát sodný (36). Viaceré štúdie preukázali výrazný nárast biologickej dostupnosti malých proteínových liečiv v prípade ich aplikácie v kombinácii s inhibítormi proteáz (37, 38). Problémom z hľadiska bezpečnosti je však fakt, že exogénne inhibítory proteáz môžu zvýšiť koncentráciu proteínov v pľúcnom parenchýme a tým narušiť homeostázu na povrchu dýchacích ciest (39).

Enhancery absorpcie

Jedným z najjednoduchších a najdôkladnejšie preskúmaných spôsobov, ako zvýšiť transmukóznu permeabilitu paracelulárnou alebo transcelulárnou cestou je použitie absorpčných enhancerov. Ich účinok je závislý od dávky a môže byť spojený s potenciálnou toxicitou. Absorpčné enhancery pre pľúcnu aplikáciu zahŕňajú: a) surfaktanty; b) katiónové polyméry; a c) cyklodextríny (16).

Zo skupiny surfaktantov sa ako efektívne ukázali predovšetkým fosfolipidy, čo preukázali štúdie zamerané na podporu transportu paratyroidného hormónu vo forme suchého prášku s obsahom DPPC z pľúcnych alveol do krvného obehu (40), alebo využitie distearoylfosfoetanolamín-polyetylénglykolu na zlepšenie systémovej absorpcie kalcitonínu po intrapulmonálnom podaní bez poškodenia lokálnych pľúcnych membrán (41). Okrem toho bolo preukázané, že rôzne typy hydrofóbnych mastných kyselín vo fosfolipidoch môžu viesť k rozdielnej systémovej biologickej dostupnosti inhalovaných proteínov. Napríklad lipidy obsahujúce palmitoylovú skupinu, ako sú DPPC a fosfatidylcholín z vaječného žĺtka, zosilnili pľúcnu absorpciu inzulínu 6,7 -⁠ a 3,4-násobne, zatiaľ čo dilauroylfosfatidylcholín, distearoylfosfatidylcholín a dimyristoylfosfatidylcholín bez palmitoylovej skupiny nevykazovali žiadny účinok podporujúci absorpciu (42).

Ďalšou zaujímavou skupinou enhancerov sú žlčové kyseliny a ich deriváty, ako sú napr. sodné soli cholátu, deoxycholátu, taurocholátu, taurodeoxycholátu, glykocholátu a glykodeoxycholátu (43). Z nich je sodná soľ taurocholátu jednou z najčastejšie používaných žlčových solí na zvýšenie systémovej absorpcie aerosolizovaných proteínov (44).

Mastné kyseliny a ich deriváty s rôznou štruktúrou tiež preukázali schopnosť zvyšovať pľúcnu absorpciu peptidov a proteínov. V prípade kyseliny kaprínovej a kyseliny laurovej sa predpokladá mechanizmus založený na zvýšení hladín intracelulárneho vápnika prostredníctvom fosfolipázy C. Zvýšené hladiny vápnika následne vedú ku kontrakcii kalmodulín-dependentných aktínových mikrofilamentov, dilatácii tesných spojení alebo fluidizácii plazmatickej membrány (45). Rovnako tak Ghadiri a kol. (43) preukázali, že dekanoát sodný zvyšuje transport biologík s nízkou permeabilitou naprieč bronchiálnym epitelom. Permeabilitu epitelu úpravou lokálneho lipidového prostredia ovplyvňujú polynenasýtené mastné kyseliny ako napr. kyselina dokosahexaénová, eikosapentaénová, linolová, palmitolejová alebo arachidónová (46, 47). Napriek priaznivým výsledkom pretrvávajú obavy z poškodenia mukóznej bariéry, najmä pri liečbe chronických ochorení.

Katiónové polyméry s inherentným pozitívnym nábojom v polymérnom skelete alebo jeho postranných reťazcoch predstavujú ďalšiu skupinu látok schopných zvýšiť absorpciu makromolekúl. Patria sem prírodné polyméry (želatína, dextrán, chitozán), ale aj syntetické polyméry (poly(amidoamín) –⁠ PAMAM, poly-L-lyzín, polyetylénimín)) (48). Najperspektívnejším katiónovým polymérom je však chitozán a jeho deriváty, a to na základe jeho dobrej biokompatibility a biodegradovateľnosti (49). Mechanizmus jeho účinku zahŕňa kombináciu mukoadhézie a regulácie tesných spojení (50). Protonované aminoskupiny chitozánu interagujú s negatívne nabitými sialovými zvyškami mucínu, čím dochádza k ovplyvneniu paracelulárneho transportu redukciou transepiteliálneho elektrického náboja a zmenou priestorového rozloženia proteínov asociovaných s tesnými spojeniami ako je filamentózny aktín a proteín Zonula occludens-1 (51). Z derivátov chitozánu boli najkomplexnejšie preskúmaný N-trimetylchitozán, ktorého použitie viedlo k výraznému zvýšeniu permeácie cez bronchiálny epitel a biologickej dostupnosti oktreotid acetátu pri jeho podaní inhalačnou cestou (52). Skúmané boli aj oligoméry chitozánu (dimér, tetramér a hexamér), ktoré oproti monomérnej forme vykazujú vyššiu rozpustnosť a nižšiu molekulovú hmotnosť. Zhang a kol. (53) preukázali, že najmä hexamér chitozánu pri koncentrácii 0,5 % (w/v) účinne zvyšuje pľúcnu absorpciu lososieho kalcitonínu s 1,9-násobným zvýšením biologickej dostupnosti.

Kombinácia cyklodextrínov (CDs) s terapeutickými proteínmi je taktiež jedným zo spôsobov zvýšenia mukóznej absorpcie biologicky aktívnych molekúl. Mechanizmus účinku však nie je jednoznačne opísaný. Môže zahŕňať tvorbu komplexov s lipofilnými penetračnými zložkami, inhibíciu proteolytickej aktivity, alebo extrakciu membránových proteínov. Okrem toho boli tieto látky skúmané aj pre ich zlepšenie fyzikálnych a chemických vlastností liečiv, ako je solubilizácia a stabilizácia. Existuje viacero štúdií, ktoré dokazujú zvýšenú biologickú dostupnosť pri perorálnom a nazálnom podaní, avšak len málo takých, ktoré sa zaoberajú pľúcnou aplikáciou cyklodextrínov. Účinnosť jednotlivých CDs pri podpore transmukózneho transportu proteínov bola pozorovaná v nasledovnom poradí: dimetyl-β-CD > α-CD > β-CD > γ-CD > hydroxypropyl-β-CD (54). Z doteraz publikovaných štúdií bol preukázaný efekt dimetyl-β-CD na zvýšenie pľúcnej absorpcie inzulínu (55) a efekt zlepšenej absorpcie inhalačne podaného cyklického peptidu FK224 v prítomnosti β-CD (56).

Fúzne proteíny ako enhancery transcytózy

Ďalšou z možností zvýšenia systémovej absorpcie inhalačne podávaných proteínov a peptidov je ovplyvnenie procesu transcytózy v epiteli pľúcneho tkaniva. Biologické liečivo dokáže pomocou transcytózy prejsť z pľúc do systémového obehu prostredníctvom špecifických aktívnych transportných ciest fúziou terapeutickej molekuly s proteínom, ktorý selektívne interaguje s receptormi na pľúcach (57). Neonatálny Fc receptor (FcRn) sprostredkuje transport proteínov z luménu dýchacích ciest do krvného obehu, čo umožňuje ich efektívnu pľúcnu distribúciu. V dôsledku toho je fúzia Fc domény IgG s biologickým liečivom považovaná za účinnú stratégiu zlepšenia prestupu cez tkanivo respiračného traktu (58). Tieto hybridné biomakromolekuly zároveň vykazujú predĺžený plazmatický polčas, ktorý je výsledkom väzby FcRn a následného ochránenia IgG pred lyzozomálnou degradáciou (59). Bolo preukázané, že absorpčná transcytóza fúznych proteínov je závislá od pH, teploty a koncentrácie. Afinita väzby na FcRn je vyššia pri mierne kyslom pH (≤ 6,5) a pri fyziologickej teplote (37 °C) (60). IgG1 je identifikovaný ako podtrieda IgG s najväčšou afinitou k FcRn. Bitonti a kol. (61) opísali prípravu konjugátu erytropoetínu s Fc doménou IgG1 a preukázali 2,3-násobné zvýšenie pľúcnej absorpcie prostredníctvom FcRn sprostredkovaného transportu v porovnaní s erytropoetínom podaným samostatne, pričom účinok bol výraznejší pri depozícii v horných dýchacích cestách. Vallee a kol. (62) zase preukázali, že monomérny Fc-fúzny proteín interferónu beta (IFNβ) sa po inhalácii vstrebával prostredníctvom imunoglobulínového transportného systému, pričom vykazoval 2,2-násobné zvýšenie systémovej absorpcie a trojnásobne predĺžený biologický polčas. Napriek obmedzenému množstvu dostupných dát sa pľúcne podávanie terapeutických Fc-fúznych proteínov presahujúcich MW 10 kDa javí ako perspektívna alternatíva k parenterálnym liekovým formám.

Záver

Moderné trendy vo vývoji účinných liečiv prinášajú inovácie aj z hľadiska možnosti ich aplikácie. Skúmané sú prístupy, ktoré by efektívnym spôsobom minimalizovali potrebu podávania liečiva vo vysokých dávkach a zároveň zvyšovali compliance pacienta (napr. potlačenie diskomfortu vyvolaného parenterálnou aplikáciou). Zvýšená pozornosť je v súčasnosti venovaná monoklonálnym protilátkam a perspektívam ich podania inhalačnou cestou, ktorá predstavuje perspektívnu alternatívu k tradičnému parenterálnemu podaniu. Pľúca poskytujú priaznivé podmienky pre lokálne aj systémové pôsobenie biologík, avšak ich účinné využitie je limitované viacerými anatomickými, fyziologickými a imunologickými bariérami, ako sú mukociliárny klírens, fagocytóza alveolárnymi makrofágmi a enzymatická degradácia.

Pokročilé formulačné stratégie, najmä chemická modifikácia proteínov prostredníctvom PEG-ylácie a perspektívnych zwitteriónových polymérov, umožňujú zlepšiť stabilitu, pľúcnu retenciu a biologickú dostupnosť inhalovaných biologických liečiv. Zatiaľ čo PEG-ylácia predstavuje etablovaný prístup, jej potenciálne obmedzenia podporujú vývoj nových polymérnych systémov s priaznivejším farmakokinetickým a bezpečnostným profilom.

Napriek sľubným predklinickým výsledkom však zostáva klinická aplikácia inhalačne podávaných mAbs výzvou. Do budúcnosti s určitosťou možno predpokladať zameranie výskumu na optimalizáciu formulácií, inhalačných technológií a dlhodobé hodnotenie bezpečnosti pre možnosť plnohodnotného uplatnenia v klinickej praxi.

Poďakovanie:

Táto práca bola podporená Agentúrou na podporu výskumu
a vývoja na základe Zmluvy č. APVV-23-0508. Všetky obrázky
uvedené v práci boli vytvorené s použitím programu Illustrae –⁠ Professional Scientific Illustration Platform (Illustrae Ltd
(trading as "Illustrae") 7 –⁠ 9 The Avenue, Eastbourne, BN21 3YA, Veľká Británia).