Úloha imunologických markerů v diagnostice kolorektálního karcinomu

Overview

Úvod: Kolorektální karcinom (CRC) stále patří mezi nejčastěji se vyskytující solidní nádory v západní populaci. I přes pokroky ve screeningu, diagnostice a léčbě dosud neexistují specifické testy pro časnou diagnózu a sledované hodnoty, které by byly jednoznačně specifické pro rizikové pacienty, případně by sloužily k monitoraci průběhu choroby lépe než dosud známé nádorové markery. Patogeneze onemocnění je úzce spojena s chronickým zánětem, oxidativním stresem a remodelací nádorového mikroprostředí. Předmětem našeho studia je několik markerů, které jsme vybrali na základě dostupné literatury a které úzce souvisí s výše uvedeným. LOX-1 (lectin-like oxidized LDL receptor-1), RAGE (receptor for advanced glycation end products), HMGB1 (high mobility group box-1) a matrixová metaloproteináza MMP-19 se podílejí na regulaci zánětlivých signálních drah, angiogenezi a degradaci extracelulární matrix. Cílem naší práce je potvrdit hypotézu, že exprese daných markerů je signifikantně zvýšena u pacientů s CRC oproti zdravým kontrolám. Metodika: Do studie byly zařazeny vzorky střevní tkáně od 34 pacientů s CRC a vzorky 21 pacientů ze skupiny kontrol, kteří podstoupili na našem pracovišti střevní resekci pro nenádorové nezánětlivé onemocnění. U onkologických pacientů jsme analyzovali tři typy tkáně –⁠ makroskopicky zdravou tkáň, přechodovou zónu a nádorovou tkáň. Vzorky byly zpracovány za užití imunohistochemických metod a hodnotili jsme pozitivitu markerů v několika typech buněčných populací. Výsledky: Zjistili jsme statisticky významné rozdíly v expresi některých markerů mezi kontrolní skupinou a pacienty s CRC. LOX-1 vykazoval zvýšenou expresi v epitelu a vaskulárních strukturách nádoru. RAGE byl zvýšen v cévních strukturách a přechodové zóně tumoru, což naznačuje jeho roli v zánětlivém mikroprostředí nádoru. Exprese MMP-19 byla nejvýraznější v oblasti přechodu nádoru do zdravé tkáně, což odpovídá její funkci při remodelaci extracelulární matrix a invazi tumoru. Závěr: Studie prokazuje význam uvedených markerů v patogenezi CRC. Jejich exprese může mít význam nejen pro lepší pochopení biologické aktivity CRC, ale i jako možné prognostické markery nebo potenciální terapeutické cíle.

Klíčová slova:

biomarkery – kolorektální karcinom – nádorové mikroprostředí – LOX-1 – RAGE – MMP-19 – HMGB1

Úvod

Kolorektální karcinom (colorectal cancer –⁠ CRC) patří mezi nejčastější malignity a významné příčiny úmrtí na nádorová onemocnění celosvětově [1]. Přestože screeningové programy vedly ke zlepšení časného záchytu onemocnění, stále chybí dostatečně senzitivní a specifické biomarkery umožňující přesnější diagnostiku, prognostickou stratifikaci a monitoraci biologického chování nádoru [2,3]. Patogeneze CRC je úzce spojena s chronickým zánětem, oxidačním stresem a remodelací nádorového mikroprostředí.

Mezi molekuly podílející se na těchto procesech patří receptor pro produkty pokročilé glykace (receptor for advanced glycation end products –⁠ RAGE), protein HMGB1 (high mobility group box 1), receptor pro oxidované LDL (lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 –⁠ LOX-1) a matrixová metaloproteináza MMP-19. RAGE aktivuje řadu signálních drah podporujících přežívání nádorových buněk a progresi nádoru [3,4]. LOX-1 představuje významné spojení mezi metabolizmem lipidů, oxidačním stresem a kancerogenezí [5–7]. MMP-19 se podílí na remodelaci extracelulární matrix, angiogenezi a buněčné migraci [8–11]. V našem předchozím výzkumu jsme prokázali zvýšenou expresi MMP-19 v epitelu a sníženou expresi v makrofázích u pacientů s CRC [12,13].

Cílem této studie bylo zhodnotit expresi LOX-1, RAGE, HMGB1 a MMP-19 v různých tkáňových kompartmentech pacientů s CRC a porovnat ji s kontrolní skupinou.

Metodika

Do studie bylo zařazeno 34 pacientů s histologicky potvrzeným CRC a 21 kontrolních pacientů operovaných pro nenádorová a nezánětlivá onemocnění střeva. U pacientů s CRC byly analyzovány vzorky z centra nádoru, přechodové zóny mezi nádorem a makroskopicky zdravou tkání a z makroskopicky zdravé tkáně resekčního okraje. U kontrol byl analyzován vzorek z resekčního okraje.

Vzorky byly zpracovány standardní metodikou formalinem fixovaných a do parafínu zalitých tkání a následně imunohistochemicky vyšetřeny na přítomnost markerů LOX-1, RAGE, HMGB1 a MMP-19 (obr. 1). Hodnocení provedl zkušený patolog zaslepený vůči klinickým údajům. Celkem bylo analyzováno 516 imunohistochemicky barvených preparátů. Ke statistickému hodnocení byl použit Mannův-Whitneyův test s hladinou významnosti p < 0,05. Práce byla schválena etickou komisí.

Výsledky

Statisticky významně vyšší expresi vykazoval LOX-1 u pacientů s CRC oproti kontrolní skupině v epitelu makroskopicky zdravé tkáně (p = 0,000019), přechodové zóny (p = 0,000084) i centra nádoru (p = 0,017) (graf 1). Zvýšená exprese byla dále prokázána v cévních strukturách přechodové zóny (p = 0,013) a v neuroendokrinních buňkách makroskopicky zdravé tkáně (p = 0,009) i přechodové zóny (p = 0,029).

Zvýšenou expresi vykazoval RAGE zejména v epitelu a cévních strukturách. V epitelu byl signifikantní rozdíl mezi kontrolní skupinou a makroskopicky zdravou tkání pacientů s CRC (p = 0,0003). V cévních strukturách byly významné rozdíly prokázány mezi kontrolní skupinou a makroskopicky zdravou tkání (p = 0,0065), přechodovou zónou (p = 0,0002) i centrem nádoru (p = 0,011) (tab. 1).

U HMGB1 byla v epitelu prokázána vyšší exprese v makroskopicky zdravé tkáni (p = 0,032) a v přechodové zóně nádoru (p = 0,018) ve srovnání s kontrolní skupinou. V centru nádoru nebyl rozdíl statisticky významný.

Zvýšenou expresi vykazovala MMP-19 v epitelu přechodové zóny nádoru ve srovnání s kontrolní skupinou (p = 0,019). Současně byla ve skupině CRC pozorována vyšší exprese MMP-19 v epitelu a nižší exprese v makrofázích ve srovnání s kontrolní skupinou.

Diskuze

Naše výsledky potvrzují význam sledovaných markerů v biologii CRC a naznačují jejich vzájemné propojení v procesech vedoucích k nádorové progresi. Nejvýraznější změny byly opakovaně pozorovány v přechodové zóně mezi nádorem a okolní tkání, která představuje oblast nejvyšší biologické aktivity nádoru charakterizovanou intenzivní angiogenezí, remodelací extracelulární matrix a nádorovou invazí.

Nejsilnější a nejkonzistentnější výsledky byly zjištěny u markeru LOX-1. Zvýšená exprese byla přítomna nejen v nádorové tkáni, ale také v makroskopicky zdravé tkáni pacientů s CRC. LOX-1 je považován za marker oxidativního stresu a jeho aktivace vede ke stimulaci proonkogenních drah podporujících proliferaci, přežívání a invazivitu nádorových buněk [5,6]. Zvýšená pozitivita v cévních strukturách přechodové zóny pravděpodobně odráží intenzivní angiogenezi v oblasti invazivní fronty nádoru. Přítomnost zvýšené exprese v neuroendokrinních buňkách může souviset s jejich vysokou metabolickou aktivitou a odpovědí na zánětlivé a stresové podněty v nádorovém mikroprostředí.

Podobný vzorec exprese byl pozorován u RAGE. Aktivace osy RAGE je spojována s chronickým zánětem a aktivací drah NF-kB, MAPK a PI3K/Akt [4]. Nejvýraznější rozdíly byly zaznamenány v cévních strukturách přechodové zóny, což podporuje předpoklad, že RAGE se podílí na regulaci angiogeneze a zánětlivého mikroprostředí nádoru. Skutečnost, že zvýšená exprese byla přítomna i v makroskopicky zdravé tkáni pacientů s CRC, naznačuje, že změny související s kancerogenezí nejsou omezeny pouze na vlastní nádor.

Velmi zajímavým nálezem byla exprese HMGB1. Zvýšená pozitivita byla prokázána v epitelu makroskopicky zdravé tkáně a přechodové zóny nádoru, nikoliv však v centru nádoru. Tento nález podporuje koncept field cancerization, podle kterého molekulární změny spojené s nádorovou transformací přesahují hranice vlastního nádoru a zasahují i histologicky nepostiženou okolní tkáň. HMGB1 je známý svou úlohou v regulaci odpovědi na buněčný stres, poškození DNA a zánět [14]. Jeho zvýšená exprese tak může odrážet časné změny probíhající ve tkáni predisponované k maligní transformaci spíše než vlastnosti již plně vyvinuté nádorové masy. Absence významného rozdílu v centru nádoru může souviset s hypoxií, nekrózou nebo translokací HMGB1 do extracelulárního prostoru.

Výsledky MMP-19 odpovídají její známé úloze při remodelaci extracelulární matrix a nádorové invazi [9,10]. Zvýšená exprese byla pozorována především v přechodové zóně nádoru, tedy v oblasti označované jako invasive front. V této lokalizaci dochází k nejintenzivnější remodelaci extracelulární matrix a interakci mezi nádorem a okolní tkání. Naopak v centru nádoru, kde často převažují hypoxické a nekrotické změny, nebyla exprese MMP-19 významně zvýšena. Ve spojení s našimi předchozími výsledky [12,13] se domníváme, že poměr exprese MMP-19 v epitelu a makrofázích by mohl představovat pomocný diagnostický nebo prognostický marker.

Naše výsledky naznačují, že oxidativní stres, zánětlivá signalizace a remodelace extracelulární matrix nepředstavují izolované procesy, ale vzájemně propojené mechanizmy podílející se na progresi CRC. Zvláště zajímavým zjištěním je přítomnost významných změn exprese některých markerů již v makroskopicky zdravé tkáni pacientů s CRC. Tento nález podporuje představu, že biologicky aktivní změny spojené s nádorovou transformací vznikají ještě před rozvojem zjevné morfologické nádorové léze a mohou se podílet na vytváření mikroprostředí příznivého pro další progresi onemocnění.

Závěr

Studie prokázala významné rozdíly v expresi markerů LOX-1, RAGE, HMGB1 a MMP-19 mezi pacienty s CRC a kontrolní skupinou. Nejzajímavější nálezy byly zjištěny v přechodové zóně nádoru a v makroskopicky zdravé tkáni pacientů s CRC, což naznačuje, že molekulární změny spojené s kancerogenezí přesahují hranice vlastního nádoru. Identifikace těchto změn by v budoucnu mohla přispět k přesnější diagnostice biologicky aktivních lézí a k lepší stratifikaci pacientů podle rizika progrese onemocnění. Další výzkum by měl ověřit prognostický význam sledovaných markerů a posoudit možnost jejich využití v klinické praxi.

Dedikace

Práce byla podpořena interním grantem FNB č. 22-IGS04-12t.