Dysregulace dlouhých nekódujících RNA u multiformního glioblastomu a jejich studium s využitím moderních molekulárně-genetických přístupů
Authors:
M. Večeřa 1; J. Šána 1; R. Bútová 1; Š. Reguli 2; M. Hermanová 3; L. Křen 4; R. Lipina 2; M. Smrčka 5; O. Slabý 1
Authors‘ workplace:
CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno
1; Neurochirurgická klinika LF UO a FN Ostrava
2; I. patologicko-anatomický ústav, LF MU a FN u sv. Anny v Brně
3; Ústav patologie, LF MU a FN Brno
4; Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno
5
Published in:
Klin Onkol 2018; 31(Supplementum1): 168-170
Category:
Article
Overview
Východiska:
Glioblastom (GBM) je nejčastější primární nádor mozku, který je charakterizován nepříznivou prognózou i navzdory veškeré dostupné léčbě. Z tohoto důvodu je vynaloženo mnoho finančních prostředků a úsilí do výzkumu nových prognostických a prediktivních biomarkerů či terapeutických cílů. Dlouhé nekódující RNA (long non-coding – lncRNA) jsou regulátory genové exprese, které hrají významnou roli v patologii GBM, a zdají se proto být vhodnými kandidáty ke studiu.
Materiál a metody:
Naše studie zahrnovala 14 pacientů s GBM a 8 pacientů s intraktabilní epilepsií, kterým byla odebrána mozková tkáň v rámci epileptochirurgických výkonů. Ribozomální RNA depletovaná RNA byla použita na sekvenování pomocí přístroje NextSeq 500 (Illumina). Statistickou analýzou bylo vyhodnoceno 24 087 mRNA a 8 414 lncRNA a jejich sekvenčních variant s nenulovým RPKM (počet readů na kilobázi na milión mapovaných readů) alespoň v jednom vzorku. Pro mapování sekvencí na referenční genom a součet čtení připadajících na cílovou sekvenci byl použit CLC Genomic Workbench. Cílené utlumení zvýšené exprese ZFAS1 bylo provedeno pomocí tranzientní transfekce specifické skupiny dvouvláknových RNA (small interfering – siRNA) do stabilních GBM linií (A172, U87MG, T98G). Úspěšnost transfekce byla ověřena prostřednictvím kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce a vliv na viabilitu pomocí MTT assay.
Výsledky:
Statistickou analýzou bylo objeveno 274 (p < 0,01) lncRNA dysregulovaných ve tkáňových vzorcích GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Sekvenování taktéž odhalilo 489 dysregulovaných mRNA (p < 0,001) a 26 mRNA (p < 0,000001). Transfekce inhibitoru ZFAS1, jedné z identifikovaných lncRNA, vedla k úspěšnému utlumení hladiny ZFAS1, které ovšem nemělo vliv na snížení míry proliferace buněčných linií.
Závěr:
Popsali jsme významnou dysregulaci lncRNA a mRNA ve tkáních GBM v porovnání s nenádorovou tkání. Dále jsme úspěšně utlumili hladinu ZFAS1, což ovšem nemělo vliv na proliferaci glioblastomových buněk.
Klíčová slova:
glioblastom – dlouhé nekódující RNA – sekvenování nové generace
Východiska
Glioblastom (GMB) je nejčastější primární maligní intrakraniální tumor mozku, který je spjatý s velmi nepříznivou prognózou a terapeutickou odpovědí [1]. Konvenční léčba je sestavena z chirurgické resekce a konkomitantní chemoradioterapie s temozolomidem (TMZ), a v některých případech z následné aplikace TMZ v monoterapii [2]. Medián celkového přežití (overall survival – OS) pacientů mladších 70 let se pohybuje přibližně mezi 12 a 16 měsíci od stanovení diagnózy [1,3]. Standardní histopatologická diagnostika bohužel není schopna reflektovat tuto variabilitu v přežívaní [4]. Studium molekulárního pozadí GBM je z tohoto hlediska tedy klíčovým přístupem vedoucím nejen ke správné diagnóze, ale i k přesnějšímu určení prognózy, příp. predikce terapeutické odpovědi [5]. Epigenetické umlčení genu MGMT metylací jeho promotorové oblasti je jediným doposud známým molekulárním prediktivním markerem odpovědi na léčbu TMZ [6,7]. Jedním z pozitivních prognostických molekulárních markerů u GBM je heterozygotní mutace genu IDH1 v kodonu 132 s výskytem přibližně 12 % a téměř výlučně v sekundárních GBM [8]. Největší pokrok a detailnější poznání v této oblasti umožnil rozvoj nových metod vč. sekvenování nové generace, které odhalilo mnoho genetických aberací v nádorovém genomu GBM a dysregulaci hladin exprese vybraných skupin genů.
Jednou z těchto skupin jsou i dlouhé nekódující RNA (long non-coding – lncRNA), které jsou definované jako transkripty delší 200 nt bez schopnosti kódovat proteiny sloužící v buněčné fyziologii jako strukturní a regulační jednotky. V lidském organizmu bylo doposud identifikováno 50 000 lncRNA, o jejichž fyziologických a aberantních funkcích je zatím známo málo [9,10]. Současné studie u GBM se zabývají především schopností lncRNA plnit role nových prognostických a prediktivních biomarkerů, a možných terapeutických cílů zvyšujících efektivitu léčby GBM.
Vícero studií se zaměřilo na komparativní profilování lncRNA v nádorových a nenádorových tkáních a hledání potenciálních prognostických či prediktivních markerů GBM pomocí sekvenování a statistických a výpočetních metod. Příkladem je studie od Zhang et al, kteří v kohortě 213 GBM tumorů z The Cancer Genome Atlas identifikovali a na dvou nezávislých kohortách validovali sadu 6 lncRNA, jejichž exprese nezávisle na věku a metylačním statusu promotoru MGMT významně korelovala s OS. Tato sada zahrnovala již v literatuře popsané lncRNA PART1, MIAT a GAS5 [11]. Stejný tým se také zaměřil na asociaci exprese lncRNA s mutací IDH1 (R132). S využitím dat z Gene expression omnibus databáze identifikovali několik dysregulovaných lncRNA v GBM s touto mutací v porovnání s GBM s nemutovanou variantou. Z nich pak byly identifikovány dvě lncRNA KIAA0495 a HOTAIRM1, které vykazovaly významně sníženou expresi v GBM s mutovaným genem IDH1 a mohly by tak přispět k přesnějšímu určení prognózy [12]. Další typ studií se zabýval přímo rolí lncRNA v biologii GBM a mechanizmem jejich účinku a zkoumal, jestli by některé z nich mohly v budoucnu posloužit jako nové terapeutické cíle. Příkladem jsou HOXA11-AS s prognostickým významem a jeho silná asociace s progresí buněčného cyklu a zvýšenou proliferací nádorových buněk [13] a tumor supresorová MEG3 asociováná s p53 a zvýšenou apoptózou [14].
Materiál a metody
V naší práci jsme se zaměřili na analýzu transkriptomu 14 vzorků GBM tkáně získaných od pacientů léčených Stuppovým protokolem a 8 zdravých mozkových tkání bez známek dysplastických změn odebraných pacientům s intraktabilní epilepsií. Informovaný souhlas schválený etickou komisí byl obdržen od pacientů před započetím léčby. RNA zbavená ribozomální RNA byla použita na přípravu komplementární DNA knihoven a sekvenování pomocí přístroje NextSeq 500 (Illumina). Statistickou analýzou pak bylo vyhodnoceno 24 087 mRNA a 8 414 lncRNA a jejich sekvenčních variant s nenulovým počtem čtení genu na kilobázi délky jeho transkriptu na milión mapovaných čtení alespoň v jednom vzorku. Pro mapování sekvencí na referenční genom a součet čtení připadajících na cílovou sekvenci byl použit CLC Genomic Workbench. Cílené utlumení zvýšené exprese ZFAS1 bylo provedeno pomocí tranzientní transfekce specifické skupiny dvouvláknových RNA (small interfering – siRNA) do stabilních GBM linií (A172, U87MG, T98G) a úspěšnost transfekce byla ověřena prostředníctvím kvantitativní real-time polymerázové řetězové reakce a vliv na viabilitu pomocí MTT assay.
Výsledky
Z výše uvedeného počtu hodnocených molekul bylo statistickou analýzou objeveno 274 (p < 0,01) dysregulovaných lncRNA ve vzorcích GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Výsledky sekvenování navíc odhalily 489 dysregulovaných mRNA (p < 0,0001) a 26 mRNA (p < 0,000001). Jedna z nejvíce v GBM exprimovaných lncRNA, ZFAS1, byla vybrána pro následnou in vitro funkční analýzu v stabilních buněčných liniích A172, U87MG a T98G. Tranzientní transfekce siRNA inhibitoru ZFAS1 měla za následek sníženou expresi ZFAS1 ve všech třech buněčných liniích. Cílené utlumení exprese ZFAS1 ovšem nevedlo k významnému snížení míry proliferace a viability ani u jedné z buněčných linií.
Diskuze a závěr
Uvedené výsledky potvrdily statisticky významnou dysregulaci lncRNA a mRNA v GBM v porovnání s nenádorovými mozkovými tkáněmi. Tyto RNA tedy mají značný potenciál stát se vhodnými diagnostickými biomarkery či terapeutickými cíli u GBM. Výsledky však bude nutné validovat na širším nezávislém souboru GBM vzorků. Dále jsme úspěšně utlumili hladinu lcnRNA ZFAS1, což ovšem nemělo vliv na viabilitu a proliferaci buněčných linií. Je tedy pravděpodobné, že ZFAS1 se na nádorovém fenotypu nepodílí skrze regulaci proliferace či apoptózy, ale spíše zapojením do dějů souvisejících s migrací a invazivitou.
Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.
Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.
Tato studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví České republiky, grant č. 15-33158A. Všechna práva vyhrazena.
doc. MUDr. Ondřej Slabý, Ph.D.
CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU
Kamenice 753/5 625 00 Brno
e-mail: on.slaby@gmail.com
Obdrženo: 19. 3. 2018
Přijato: 10. 4. 2018
Sources
1. Delgado-López PD, Corrales-García EM. Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities. Clin Transl Oncol 2016; 18 (11): 1062–1071. doi: 10.1007/s12094-016-1497-x.
2. Stupp R, Hegi ME, Mason WP et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol 2009; 10 (5): 459–466. doi: 10.1016/S1470-2045 (09) 70025-7.
3. Lakomy R, Fadrus P, Slampa P et al. Multimodal treatment of glioblastoma multiforme: results of 86 consecutive patients diagnosed in period 2003–2009. Klin Onkol 2011; 24 (2): 112–120.
4. Ohgaki H, Kleihues P. The definition of primary and secondary glioblastoma. Clin Cancer Res 2013; 19 (4): 764–772. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-12-3002.
5. Verhaak RG, Hoadley KA, Purdom E et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell 2010; 17 (1): 98–110. doi: 10.1016/j.ccr.2009.12.020.
6. Agnihotri S, Gajadhar AS, Ternamian C et al. Alkylpurine-DNA-N-glycosylase confers resistance to temozolomide in xenograft models of glioblastoma multiforme and is associated with poor survival in patients. J Clin Invest 2012; 122 (1): 253–266. doi: 10.1172/JCI59334.
7. Lee SY. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes Dis 2016; 3: 198–210. doi: 10.1016/j.gendis.2016.04.007.
8. Sanson M, Marie Y, Paris S et al. Isocitrate dehydrogenase 1 codon 132 mutation is an important prognostic biomarker in gliomas. J Clin Oncol 2009; 27 (25): 4150–4154. doi: 10.1200/JCO.2009.21.9832.
9. Iyer MK, Niknafs YS, Malik R et al. The landscape of long noncoding RNAs in the human transcriptome. Nat Genet 2015; 47 (3): 199–208. doi: 10.1038/ng.3192.
10. Derrien T, Johnson R, Bussotti G et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Res 2012; 22 (9): 1775–1789. doi: 10.1101/gr.132159.111.
11. Zhang XQ, Sun S, Lam KF et al. A long non-coding RNA signature in glioblastoma multiforme predicts survival. Neurobiol Dis 2013; 58: 123–131. doi: 10.1016/j.nbd.2013.05.011.
12. Zhang XQ, Kiang KM, Wang YC et al. IDH1 mutation-associated long non-coding RNA expression profile changes in glioma. J Neurooncol 2015; 125 (2): 253–263. doi: 10.1007/s11060-015-1916-9.
13. Wang Q, Zhang J, Liu Y et al. A novel cell cycle-associated lncRNA, HOXA11-AS, is transcribed from the 5-prime end of the HOXA transcript and is a biomarker of progression in glioma. Cancer Lett 2016; 373 (2): 251–259. doi: 10.1016/j.canlet.2016.01.039.
14. Wang P, Ren Z, Sun P. Overexpression of the long non-coding RNA MEG3 impairs in vitro glioma cell proliferation. J Cell Biochem 2012; 113 (6): 1868–1874. doi: 10.1002/jcb.24055.
Labels
Paediatric clinical oncology Surgery Clinical oncologyArticle was published in
Clinical Oncology
2018 Issue Supplementum1
Most read in this issue
- Analýza mikroRNA u extramedulárního relapsu mnohočetného myelomu
- Analýza aktivity nukleosidových transportérů u chemorezistentního nádoru prostaty s využitím průtokové cytometrie
- Vývoj a přehled využití chemoterapie a role radioterapie a chirurgie u pacientů s nově diagnostikovaným tumorem a karcinomem pankreatu v běžné 5leté praxi centra
- Může analýza buněčného lipidomu přispět k rozlišení nádorových a nenádorových buněk tlustého střeva?