Problémy měření PTH při sledování chronické renální choroby. Minireview.

Cíl:
Stručný přehled analytických a klinických aspektů měření parathyroidního hormonu v séru s důrazem na posouzení srovnatelnosti současně používaných metod v klinických laboratořích.

Metoda:
Prostudování a vyhodnocení recentní odborné literatury z let 2009-2014, doplněné experimentem u souboru pa-cientů léčených na hemodialýze. V něm bylo sledováno 99 pacientů třemi metodami druhé generace (Roche, DiaSorin, Siemens DPC) a dvěma metodami 3. generace (DiaSorin, Roche).

Výsledky a diskuse:
Výsledky získané různými metodami jsou velmi odlišné. Hodnoty mediánů jsou až dvojnásobně odlišné a u zvýšených hodnot jsou rozdíly ještě vyšší. Systematické diference jsou významné nejen mezi metodami různých generací, ale (méně) i mezi metodami generací stejných. Četnost výsledků uvnitř rozhodovacího limitu KDIGO 2009 se v závislosti na použitém kitu lišila u pacientů na hemodialýze až 2,5 násobně. Prvním krokem k postupné harmonizaci měření PTH u renálně nemocných pacientů by mělo být použití 3. generace imunochemických metod. Principiálním řešením bude standardizace na bázi separačních metod LC-MS/MS.

Klíčová slova:
PTH, druhá a třetí generace, hemodialýza, srovnatelnost, standardizace.

Role PTH

Parathyroidní hormon PTH je malá proteinová molekula s 84 aminokyselinami (intaktní 1-84 PTH). Jsou známy dva prekurzory, jejichž postupným štěpením 1 -84 PTH vzniká - prePTH (115 aminokyselin) a proPTH (90 aminokyselin). Oba jsou imunochemicky nedetekovatelné. Biologický poločas PTH je krátký (2-4 minuty). Do krevního oběhu je uvolňován v závislosti na hodnotách Ca²⁺ v krvi. PTH je klíčový pro regulaci metabolismu Ca a P. Stimuluje kostní resorpci, reabsorpci Ca v ledvinách, hydroxylaci 25-OH vitaminu D v ledvinách, podílí se na snižování koncentrace anorganických fosfátů v séru. Na obrázku 1 jsou regulační role PTH a vztahy k metabolismu a funkci ledvin a kostí schematicky znázorněné. Stanovení PTH hraje důležitou roli u chronické ledvinové choroby, kostního metabolismu, hyper a hypokalcémie a u hyperparathyroidismu [1].

PTH, doporučení, chronické ledvinové choroby a poruchy elektrolytů u kostního metabolismu

Základní poznatky o interpretaci výsledků PTH u pacientů s ledvinovými chorobami a s poškozením kostního metabolismu jsou obsaženy v mezinárodním nefrologickém doporučení KDIGO 2009 [2]. V doporučení KDIGO 2009 se jako diagnostický rozhodovací limit uvádí interval 2-9*URL (upper reference limit - horní referenční limit). Hodnoty nad 2*URL by měly vždy vést k vyšetření Ca, P, ALP a 25-OH vitaminu D. U pacientů léčených hemodialýzou má být hodnota PTH udržována v rozmezí 2*URL až 9*URL. Nižší hodnoty jsou indikací k změně terapie, která by vedla ke snížení fosfátů, zvýšení Ca (pomocí léčby kalcimimetiky). Zvýšení nad hodnotu 9*URL by mělo být jedním z ukazatelů provedení parathyroidektomie. U pacientů s eGFR < 0,75 ml/s/1,73m² doporučuje KDIGO 2009 stanovení základní linie (base line) hodnot Ca, P, ALP, PTH a vitaminu D v séru a poté sledování změny v čase a závislosti na terapii. S klesající hodnotou eGFR roste počet pacientů s PTH nad URL a s deficiencí vitaminu D.

Doporučení KDIGO 2012 [3], jinak mezinárodně lékařskou veřejností široce akceptované, však zdůrazňuje především a explicitně variabilitu výsledků měření PTH v závislosti na použitých metodách (stejně tak přistupuje k měření 25-OH vitaminu D) a nezařazuje je do kontextu medicíny, založené na důkazech (EBM).

Tento přístup je odůvodněný a PTH je velmi kontroverzní analyt. Proto hodnoty rozhodovacích limitů, navržené v doporučení KDIGO 2009 jsou pro svou ne-určitost, danou neúměrně vysokou variabilitou výsledků měření, překvapivé.

K informaci a shrnutí problémů sledování poruch a léčby poruch kostního metabolismu u pacientů s chronickou renální chorobou (CKD) lze doporučit recentní literární přehled zahrnující monitorování a vyhodnocování eGFR, P, Ca, PTH a vitaminu D [4].

Variabilita měření PTH

V současnosti mají laboratoře k dispozici pro stanovení PTH imunochemické metody 2. a 3. generace. Metody 2. generace jsou komerčně označovány jako „intact“ PTH, metody 3. generace jsou označovány jako „biointact“ PTH nebo také jako „1-84 PTH“. Metody 3. generace se objevily v nabídce diagnostických souprav nedávno (až po roce 2012). V tomto okamžiku jsou na trhu promiskuitně obě generace a dokonce i výrobci nových kitů 3. generace zatím ponechávají ve svém portfoliu i metody generace druhé. Problém je v zásadní nesrovnatelnosti různých metod mezi sebou, a to větší mezi generacemi, menší, ale významné, uvnitř nich.

Obr. 2 znázorňuje zásadní rozdíl mezi 2. a 3. generací stanovení PTH. Třetí generace diagnostických kitů používá reagenční záchytné protilátky, orientované na N-terminální epitop (1-4) PTH. Cílem je vyhnout se interferenci fragmentu 7-84, působícího velké problémy zejména při interpretaci výsledků u pacientů s chronickým renálním poškozením. Kity 2. generace využívají epitopů poblíž středu molekuly PTH, což neumožní redukovat vliv interferujícího fragmentu 7-84 na výsledek měření. Kontroverzní situaci interpretace PTH podle doporučení KDIGO 2009 ještě před objevením se 3. generace metod na trhu důkladně analyzuje práce Cavaliera a spol. [7].

Zpřístupnění kitů 3. generace spletitou situaci při interpretaci výsledků ještě zkomplikovalo. Proto je logické, že v poslední době velmi narůstá počet publikací, hodnotících vztahy mezi metodami 2. a 3. generace jak z hlediska analytického (kvantita výsledků), tak klinického (interpretace výsledků především u pacientů s renální chorobou).

Obě dostupné metody biointaktního PTH (Roche, DiaSorin) byly testovány již v roce 2012 [8]. Vykázaly sice dobrou úroveň korelace, ale také systematické deviace, zvyšující se s tím, jak roste koncentrace PTH ve vzorcích. Z následujících studií výsledků a interpretace 3. generace metod PTH je vhodné zmínit práce [9, 10]. Z těchto prací se dozvíme, že metody 2. generace poskytují vyšší výsledky. U pacientů s ESRD (konečnou fází renální choroby) průměrně o 60 %, u ostatních jedinců s chronickou renální chorobou v průměru o 18 % [9]. Výsledky 3. generace údajně korelují lépe s hodnotou BMD, než výsledky, dosažené metodami 2. generace. Porovnání 2. a 3. generace je však ztíženo i tím, že ani metody 2. generace nejsou mezi sebou dobře srovnatelné [10]. Například metody 2. generace Architekt (Abbott) a Advia (Siemens) poskytují výrazně vyšší výsledky, než Vitros a Beckman téže generace. U pacientů s chronickou renální chorobou je srovnatelnost ještě podstatně horší, než u ostatních. Hodnoty PTH, získané metodami 3. generace údajně lépe korelují s Ca, P, ALP, než výsledky, získané 2. generací metod.

KDIGO 2009 obecně doporučuje udržovat PTH u pacientů s chronickou renální chorobou v rozmezí 2 až 9 násobku URL, avšak hodnoty URL jsou velmi závislé na metodě použité k měření. Logicky vznikají problémy s klinickou interpretací u pacientů, které jsou obsahem řady recentních publikací.

Práce [11] ukazuje razantní změny interpretace a diagnostické klasifikace v důsledku změny metod 2. generace (Roche, Abbott, DiaSorin) za metody 3. generace PTH (Roche, DiaSorin).

U dialyzovaných pacientů a při použití kriterií KDIGO 2009 (cut off 2-9*URL) byla získaná významně odlišná klinická klasifikace pacientů. U 3. generace PTH bylo 23 – 27 % výsledků pod cut off, u 2. generace PTH 32 – 41 %. Nad cut off bylo u 3. generace 6 – 10 %, zatímco u generace druhé to bylo 16 – 19 %.

Rozsáhlá mezilaboratorní studie Eddingtona a spol. [12] pracovala s populací dialyzovaných pacientů a s deseti kity jak druhé, tak i třetí generace metod v 17 laboratořích. Hodnoty PTH jsou u pacientů na hemo-dialýze velmi odlišné jak číselně, tak i klinicky. Rozdílná diagnostická klasifikace byla zjištěna u 36 % pacientů při použití hodnot referenčních intervalů výrobců. Po adjustaci na vlastní referenční intervaly se tato hodnota zlepšila na 16 % neshodných klasifikací. 3. generace poskytla v průměru o 28 % nižší výsledky. Korelace je dobrá u nižších koncentrací, ale jak se tyto zvyšují, korelace se zhoršuje. Byla provedena korekce (matematická) s cílem dosažení harmonizace mezi účastnícími se laboratořemi. Po ní bylo nutné překlasifikovat léčebný režim u 21 % pacientů.

Hodnoty PTH závisí na koncentraci 25-OH vitaminu D a jsou k dispozici odhady kvantifikující vztah mezi oběma analyty. Zde se nalézá v pracovních postupech výrobců řada nesrovnatelností u důležitých údajů. Například experimentálně stanovená hodnota horního referenčního limitu u kitu Abbott Architect pro populaci dostatečně saturovanou vitaminem D (75 nmol/l a výše) byla 10 pmol/l, údaj výrobce o hodnotě URL však jen 7,2 pmol/l [6].

Malá studie PTH s použitím 2. a 3. generace diagnostických souprav u dialyzovaných pacientů

Byla provedena na pracovišti autorů s použitím pěti kitů. Tři patřily do 2. generace: Roche intact PTH, DiaSorin intact PTH, Siemens PTH, dva do generace třetí: Roche 1-84 PTH, DiaSorin 1-84 PTH.

Vyhodnoceno bylo 169 výsledků od 99 pacientů na hemodialýze, ze vzorků odebraných při pravidelných měsíčních kontrolách.

Procento výsledků v intervalu hodnot 2-9*URL kolísalo u různých metod v rozmezí 24 - 65 pmol/l, tedy v intervalu zpochybňujícím nejen klinickou srovnatelnost, ale i použitelnost.

Z obr. 3 zobrazujícího výsledky měření souboru uvedenými metodami lze vyčíst následující:

• 3. generace poskytuje nižší výsledky měření, než druhá
• diference mezi mediány hodnot 2. a 3. generace jsou téměř dvojnásobné
• i metody 2. i 3. generace, produkované různými výrobci vykazují mezi sebou systematické diference
• diference mezi 2. a 3. generací jsou tím vyšší, čím vyšší je koncentrace PTH ve vzorku.

Harmonizace, standardizace, reference

Stanovení a klinická interpretace je pregnantním příkladem nezbytnosti standardizace a ukázkou silného omezení klinického významu nákladného vyšetření, pokud není standardizace provedena. Důvodem standardizace je (jako ve všech případech jiných analytů) dosažení srovnatelnosti výsledků a ustanovení relevantních referenčních intervalů a rozhodovacích mezí pro diagnózu a terapii pacientů.

Současná úroveň potřebné standardizace PTH je v samotném počátku. Nástroje budoucí standardizace však existují. Především je to nový mezinárodní standard PTH 95/646. Probíhá intenzivní vývoj referenčních metod, které budou nepochybně vytvořeny na bázi tandemové hmotnostní spektrometrie.

Strategii standardizace a její bezpodmínečnou potřebu zejména pro pacienty s renálními chorobami shrnula Sturgeonová a spol. [14]. Cavalier a spol. [15] ukázali v poslední době, že již samotné použití standardu IS 95/646 (v proteinové matrici) po rekalibraci rutinně používaných kitů 3. generace významně sníží diference mezi výsledky obou kitů jak u souboru pacientů bez chronické renální choroby, tak i u souborů dialyzovaných pacientů i u souborů pacientů s primárním hyperparathyroidismem.

Přehled současných možností a budoucích trendů stanovení PTH LC-MS/MS metodologií je souhrnně uveden v práci [16]

Pracovní skupina IFCC pro PTH

Její složení a úkoly, které řeší, naleznete na www.ifcc.org po vyhledání oddílu IFCC SD (Scientific division) a následně pododdílu WG-PTH (Pracovní skupina PTH).

Jako dlouhodobý cíl si pracovní skupina stanovila:

• podrobné otestování referenčního materiálu IS 95/646
• ustanovení referenční metody IFCC
• vytvoření definice referenční populace

Prozatímní harmonizační úsilí, do doby, než bude hotova standardizace stanovení, by mělo podle skupiny přednostně směřovat k vytvoření metodicky závislých rozhodovacích (akčních) limitů pro diagnostiku, klasifikaci a léčbu renálních pacientů. Stejný směr úsilí by měly sledovat i klinické laboratoře a zejména výrobci diagnostik.

Podpořeno grantem MH CZ - DRO (UHHK, 00179906) a programem PRVOUK P37/11.

Do redakce došlo 25. 1. 2015

Adresa pro korespondenci:

Ing. Jaroslava Vávrová, Ph.D.

ÚKBD

Fakultní nemocnice

Sokolská 581

500 12 Hradec Králové

e-mail: vavrovaj@lfhk.cuni.cz