VYUŽITIE MULTIPLEXNEJ RT PCR V DIAGNOSTIKE MIKROBIONÁLNYCH PATOGÉNOV

Souhrn

Cieľom príspevku je poukázať na potenciál využitia diagnostickej súpravy Anyplex^TM STI-7 (Seegene, Južná Kórea), ktorá využíva technológiu multiplexnej real time PCR. Anyplex^TM STI-7 umožňuje detegovať sedem najčastejších sexuálne prenosných patogénov naraz v jednej PCR reakcii. Jedná sa o šesť mikrobiálnych patogénov (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum a Ureaplasma parvum) a jeden protozoálny (Trichomonas vaginalis). Podľa údajov Európskych odporúčaní pre menežment negonokokových uretritíd z roku 2016 sú infekcie spôsobené Chlamydia trachomatis a Mycoplasma genitalium najčastejšie hlásenými sexuálne prenosnými ochoreniami. S použitím multiplexnej real time PCR Anyplex^TM STI-7 sme zistili, že v našej skupine infertilných mužov bola Ureaplasma parvum najčastejšie detegovaným patogénom.

Kľúčové slová:
multiplexná real time PCR, Anyplex^TM STI-7, chlamýdie, mykoplazmy

Úvod

Sexuálne prenosné infekcie sú príčinou neplodnosti v 35 % prípadov. Ich príčinou je široké spektrum vírusových, bakteriálnych a protozoálnych patogénov.

Podľa údajov Svetovej zdravotníckej organizácie z roku 2012 pribudne denne vo vekovej skupine od 15 do 49 rokov 131 miliónov sexuálne prenosných ochorení zapríčinených Chlamydia trachomatis, 78 miliónov Neisseria gonorrhoeae a 142 miliónov Trichomonas vaginalis [1–4]. V Európe sú najčastejšie hlásenými sexuálne prenosnými ochoreniami infekcie spôsobené Chlamydia trachomatis a Mycoplasma genitalium („Európske odporúčania pre menežment negonokokových uretritíd“, 2016) [4–10].

Pre efektívne riešenie neplodnosti je preto potrebné zaviesť komplexné vyšetrenie pacienta na najčastejšie sexuálne prenosné ochorenia. Z hľadiska laboratórnej diagnostiky sa javí ako najefektívnejší komplexný skríning pôvodcov sexuálne prenosných ochorení. Takúto možnosť ponúka súprava Anyplex^TM STI-7 (Seegene, Južná Kórea), ktorá využíva technológiu multiplexnej real time PCR. Anyplex^TM STI-7 umožňuje detegovať sedem najčastejších sexuálne prenosných patogénov naraz v jednej PCR reakcii. Jedná sa o šesť mikrobiálnych patogénov (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum a Ureaplasma parvum) a jeden protozoálny (Trichomonas vaginalis).

Anyplex^TM STI-7 a multiplexná real time PCR

Multiplexná real time PCR je vysoko citlivá metóda, ktorá využíva technológiu multiplikácie viacerých cieľových sekvencií genetického materiálu v jednej reakčnej skúmavke. V tomto procese sa využívajú viaceré páry primerov a optimalizované reakčné podmienky. Za posledné roky zaznamenala technológia výrazný rozvoj, ktorý umožnil jej použitie aj v oblastiach, ktoré vyžadujú vysokú presnosť, spoľahlivosť a reprodukovateľnosť. Jednou z nich je aj laboratórna diagnostika infekčných ochorení. Práve v tejto oblasti si metóda multiplexnej real time PCR nachádza široké uplatnenie. Umožňuje rýchlo a spoľahlivo vyšetrovať rôzne typy biologických vzoriek a detegovať v nich mikrobiálne, vírusové a protozoálne patogény. Rýchlosť a spoľahlivosť získanej informácie je hlavným benefitom tejto metódy. Okrem kvalitatívneho hodnotenia, mnohé multiplexné testy umožňujú aj semikvantitatívne hodnotenie a následne zahájiť cielenú terapiu, sledovať priebeh a efektivitu liečby. V našom laboratóriu sme testovali možnosti využitia diagnostickej súpravy Anyplex^TM STI-7(Seegene, Južná Kórea), ktorá slúži na diagnostiku hlavných patogénov sexuálne prenosných ochorení. Súprava má CE -IVD certifikát a preto je vhodná pre použitie v klinickej diagnostike. Juhokórejská firma Seegene je inovátorom v oblasti technológie multiplexnej real time PCR.

Technológia systému

Diagnostiké sety Anyplex^TM sú založené na dvoch nových inovatívnych technológiách: technológii DPO^TM a TOCE^TM [11,12].

DPO^TM technológia

Technológia využíva systém DPO primerov (Dual Priming Oligonukleotide), ktoré sú štrukturálne a funkčne odlišné od bežných primerov, pričom je blokovaná tvorba nešpecifických templátov, a tým sa dosahuje trvalo vysoká špecifickosť aj za menej optimálnych reakčných podmienok.

DPO™ sa skladá z dvoch samostatných základných priming častí (5'-koniec stabilizátor a 3'-koniec určovateľ), spojených pomocou polydeoxyinozínového linkera - spojovacieho mostíka. Linker má tvar bubliny, sám o sebe nie je zapojený do primingu, ale skôr vymedzuje hranice medzi 5'-koncom a 3'-koncom.

Princíp technológie

DPO™ má dva funkčné väzobné regióny, pričom jeden je dlhší ako druhý a sú oddelené poly (I) linkerom. Tieto dva nerovnako dlhé väzobné regióny vytvárajú dvojaké väzobné reakcie, v dôsledku čoho sa tvorí cieľovo špecifický produkt.

V prvom kroku nastáva aktivácia Poly (I) linkera deoxyinozínu, ktorý má v dôsledku slabších vodíkových väzieb pomerne nízku hodnotu teploty topenia (Tm). Poly (I) linker tvorí štruktúru bubliny pri určitej teplote topenia a oddelí 5'-koniec stabilizátora od 3'-konca určovateľa na samostatný stabilizátor a určovateľ.

V druhom kroku prebehne prvá väzobná reakcia. Dlhší 5'-koniec sa prednostne viaže na templátovú DNA a iniciuje stabilné naviazanie. Pôsobí ako stabilizátor.

V treťom kroku prebehne druhá väzobná reakcia: Krátky 3'-koniec sa selektívne viaže na cieľové miesto a je základom pre cieľovo špecifické predĺženie. Pôsobí ako určovateľ.

TOCE^TM technológia

Technológia TOCE™ umožňuje multiplexnú detekciu hľadaných cieľových sekvencií DNA v jednej reakčnej skúmavke. Technológiou TOCE™ je možné realizovať kvalitatívny a zároveň aj semikvantívny test. Je to umožnené vďaka dvom použitým analýzam: Cyclic Catcher Melting Temperature Analysis a High Resolution Melting analysis. Použitie technológií DPO^TM a TOCE™ v diagnostických súpravách posúva molekulárnu diagnostiku na novú, vyššiu úroveň.

Princíp technológie

Kľúčovými komponentmi TOCE™ technológie sú páry DPO™ primerov, pitchers a catchers. Pitcher je značkovací oligonukleotid, ktorý špecificky hybridizuje v cieľovej oblasti. Catcher je fluorescenčne značený templát.

Hodnota teploty topenia catcher-a je závislá od dĺžky sekvencie. Táto vlastnosť slúži na vytváranie dostatočne odlíšiteľných templátov. Pre optimalizáciu TOCE™ môžeme hodnotu teploty topenia catcher-a ľahko upraviť, nie je obmedzená na cieľové sekvencie. Detekčné limity diagnostickej súpravy Anyplex^TM STI-7 za použitia technológie TOCE™ sú porovnateľné s výsledkami testov na báze single plex real time PCR.

Technológia TOCE™ umožňuje identifikovať viac cieľových analytov súčasne v jednom kanáli. Signál je meraný v reálnom čase a analyzovaný na základe teploty topenia (Tm) catcher-a, ktorá slúži na detekciu prítomnosti cieľového analytu.

Parametrizácia a vyhodnotenie

V Laboratóriu pre diagnostiku infertility a banke spermií Združenej tkanivovej banky Univerzitnej nemocnice L. Pasteura v Košiciach sme vyšetrili v priebehu dvoch mesiacov 53 mužov (priemerný vek 31 rokov). Na izoláciu DNA boli použité dva typy vzoriek: ejakulát a moč. Odber biologického materiálu prebiehal v odberovej miestnosti za štandardných podmienok. Moč bol odoberaný v objeme 10-40 ml, vždy prvý prúd ranného moču. Skladovaný bol maximálne po dobu dvoch hodín, pri laboratórnej teplote a následne bol použitý na izoláciu DNA. Ejakulát bol odoberaný od pacientov po minimálne trojdňovej a maximálne sedemdňovej sexuálnej abstinencii do sterilnej nádoby. Následne prebiehalo jeho skvapalnenie v termostate po dobu 30 minút pri teplote 37°C. Vzorky ejakulátu boli použité na izoláciu DNA v časovom limite do 2 hodín od odberu. DNA bola izolovaná komerčnou súpravou od firmy QIAGEN: QIAamp DNA Mini kit. Izoláciu sme urobili podľa inštrukcií výrobcu s jedinou modifikáciou, keď sme predĺžili čas lýzy na 60 min [15]. Kvalita a koncentrácia izolovanej DNA bola stanovená spektrofotmetricky systémom NanoDrop. Na multiplexnú real time PCR sme použili prístroj od firmy BIO-RAD CFX 96 Real Time PCR System, verzia softwaru 2.0.5 a súpravu Anyplex^TM STI-7 (Seegene, Južná Kórea). Súprava Anyplex^TM STI-7 umožňuje detegovať sedem hlavných patogénov sexuálne prenosných infekcií v jednej PCR reakcii. Na obsluhu prístroja a definovanie reačných podmienok sme použili program Bio-Rad CFX Manager IVD Editor 1.6 a na kvalitatívne a semikvantitatívne vyhodnotenie výsledkov sme použili program Seegene Viewer (Obr. 3).

U 6-tich mužov sme vzorku DNA získali súbežne z ejakulátu a moču (100% zhoda výsledkov). U 5-tich mužov z tejto prvej vyšetrenej skupiny neboli potvrdené patogény. U jedného muža bola potvrdená kombinovaná infekcia Ureaplasma parvum (+) a Mycoplasma hominis (+). Zvyšnú skupinu tvorilo 47 mužov, kde sme vzorku DNA získali len z ejakulátu. U siedmich mužov v ejakuláte sme identifikovali Ureaplasmu parvum (++) a u jedného Ureaplasmu urealyticum (+). Vzorky ejakulátu 39 mužov z druhej vyšetrenej skupiny boli negatívne.

Diskusia a záver

Uvedenou metódou sme otestovali 53 vzoriek DNA izolovanej z moču a ejakulátu. Jedným zo zámerov testovania bolo zistiť využiteľnosť súpravy Anyplex^TM STI-7 pre diagnostiku sexuálne prenosných ochorení z ejakulátu. Uvedený typ vzoriek sme testovali pre jednoduchosť prístupu k vzorkám, v Laboratóriu pre diagnostiku infertility sú vyšetrované spermiogramy infertilných mužov. Vzhľadom na odporúčania autorít vyšetrovať prvý prúd moču a/alebo výter z uretry metódami amplifikácie nukleových kyselín sme u niekoľkých pacientov porovnali výsledky vyšetrení vzoriek ejakulátu a moču.

Optimalizáciou podmienok izolácie DNA z ejakulátu sme docielili využiteľnosť súpravy Anyplex^TM STI-7 aj pre dôkaz vybraných sexuálne prenosných patogénov v ejakuláte. Úspešnosť optimalizácie bola potvrdená spektrofotometrickým sledovaním výťažnosti a kvality DNA. Benefitom súpravy Anyplex^TM STI-7 je interná kontrola kvality, ktorá slúži na kontrolu kvality izolácie DNA a možnosť vplyvu inhibičných látok na amplifikáciu DNA. Tým sa zároveň vylúčia falošne negatívne výsledky vyšetrenia.

Test je vhodný pre rýchlu laboratórnu diagnostiku sexuálne prenosných ochorení, umožňuje získať výsledok v deň odberu vzorky.

Môžeme konštatovať, že multiplexná real time PCR je vysoko citlivá metóda vhodná na skríning a diagnostiku sexuálne prenosných infekcií. Použitie in vitro diagnostických súprav Anyplex^TM STI-7 umožňuje súčasnú detekciu siedmich patogénov sexuálne prenosných ochorení v jednej PCR reakcii, čím sa stáva diagnostika jednoduchšou a finančne efektívnejšou. V prípade potreby je možné získať finálne výsledky do siedmich hodín. Diagnostická súprava Anyplex^TM STI-7 a použitý real time PCR systém CFX 96 spĺňa kritéria CE-IVD.

Poďakovanie

Práca bola podporená výzkumným grantom Vega č. 1/0515/13.

Dr.h.c. prof. Ing. Jozef Živčák, Ph.D.

Katedra biomedicínskeho inžinierstva a merania

Strojnícka fakulta

Technická univerzita v Košicach

Letná 9, SK-042 00 Košice

E-mail: jozef.zivcak@tuke.sk

Phone: +421 556 022 381