Cirkulující myeloidní supresorové buňky a jejich úloha v nádorové imunologii

Circulating Myeloid Suppressor Cells and Their Role in Tumour Immunology

Background:
Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) are heterogenic population of multipotent progenitors of myeloid lineage. For their immunosuppressive effect, MDSC are responsible for tumour escape from the host immune surveillance. Furthermore, MDSCs support tumour by promotion of angiogenesis and metastasis. Membrane markers of human MDSCs are myeloid markers CD11b and CD13, these cells are HLA-Dr^low/– and expression of CD15 or CD14 differentiate them into granulocytic (Gr-MDSCs) and monocytic (Mo-MDSCs), resp.

Patients and Methods:
Using flow cytometry, we investigated Mo-MDSC counts in peripheral blood of non-cancer individuals – control group (n = 61), breast (n = 39) and colorectal (n = 52) cancer patients. These cells were detected as CD45⁺CD11b⁺CD33⁺CD14⁺HLA-Dr^low/– and quantified as percentage of total white blood cells and as absolute count.

Results:
In control group, circulating Mo-MDSCs was gender-and age-independent and the average value was 1.09% and 0.073 × 10⁹/l. Breast cancer patients had higher circulating Mo-MDSCs compared to control group with average values: 3.57% and 0.229 × 10⁹/l (p < 0.001) and we also observed increase in Mo-MDSC number after granulopoietic growth factors administration (p = 0.043). Colorectal cancer patients had higher average number of circulating Mo-MDSCs compared to control group: 1.71% a 0.125 × 10⁹/l (p = 0.003) and its number did not correlate with tumour clinicopathological stage, localization of primary tumour (colon vs. rectum), site (left vs. right) and microsatellite instability.

Conclusion:
Increased number of MDSCs in circulation and within tumour microenvironment has been associated with immune suppression and tumour progression. Colorectal cancer patients at diagnosis showed higher circulating Mo-MDSCs possibly reflecting immunosuppressive effect of tumour microenvironment. Change of Mo-MDSC number from baseline level need to be evaluated in the context of CRC patients outcome. Recombinant granulopoietic growth factors increase number of circulating Mo-MDSCs and the effect of this phenomenon on cancer prognosis remains to be elucidated.

Key words:
myeloid-derived suppressor cells – colorectal cancer – breast cancer – immunology – immunosuppression – G-CSF

This work was supported by MEYS by NPU I (LO1413), grant AZV 16-31966A and MH DRO 00209805.

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Submitted:
11. 3. 2017

Accepted:
26. 3. 2017

Autoři: K. Pilátová ^1,2; E. Budinská ¹; B. Bensciková ^1,3; R. Nenutil ^1,4; R. Šefr ^1,5; L. Fědorová ^1,2; B. Hanáková ¹; V. Brychtová ¹; L. Zdražilová Dubská ^1,2
Působiště autorů: RECAMO, Masarykův onkologický ústav, Brno ¹; Oddělení laboratorní medicíny, Masarykův onkologický ústav, Brno ²; Klinika komplexní onkologické péče, Masarykův onkologický ústav, Brno ³; Oddělení onkologické patologie, Masarykův onkologický ústav, Brno ⁴; Klinika operační onkologie, Masarykův onkologický ústav, Brno ⁵
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2017; 30(Supplementum1): 166-169
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
Myeloidní supresorové buňky (MDSC) jsou heterogenní populací multipotentních progenitorových buněk myeloidního původu. Vzhledem k jejich imunosupresivnímu účinku se podílejí na úniku nádoru imunitnímu dohledu. K nádorovému růstu přispívají i dalšími mechanizmy, jako jsou podpora nádorové angiogeneze a metastazování. Membránové markery lidských MDSC jsou znaky myeloidních buněk CD11b a CD33, dále jsou HLA-Dr^low/– a dle exprese znaků CD15 nebo CD14 je lze rozlišit na skupinu granulocytárních (Gr-MDSC) a monocytárních (Mo-MDSC) MDSC.

Soubor pacientů a metody:
Zastoupení Mo-MDSC v periferní krvi jsme stanovili u kontrolní populace (bez nádorového onemocnění) (n = 61), u pacientů se zhoubným novotvarem prsu (n = 39) a kolorektálním karcinomem (n = 52). Mo-MDSC byly detekovány na průtokovém cytometru jako buňky s imunofenotypem CD45⁺CD11b⁺CD33⁺HLA-Dr^low/–CD14⁺.

Výsledky:
Průměrný počet cirkulujících Mo-MDSC v kontrolní populaci byl 1,09 % z celkových leukocytů, tj. 0,073 × 10⁹/l a nezávisel na věku a pohlaví. U pacientek s karcinomem prsu byl průměrný počet Mo-MDSC vyšší než u kontrolní populace: 3,57 % a 0,229 × 10⁹/l (p < 0,001) a po podání růstových faktorů granulopoézy byl pozorován jejich významný nárůst (p = 0,043). Pacienti s kolorektálním karcinomem měli vyšší průměrný počet cirkulujících Mo-MDSC ve srovnání s kontrolní populací v době stanovení diagnózy: 1,71 % a 0,125 × 10⁹/l (p = 0,003) a jejich počet nekoreloval s klinicko-patologickým stadiem, lokalizací (kolon vs. rektum), umístěním (levostranné vs. pravostranné) a mikrosatelitovou nestabilitou nádoru.

Závěr:
Zvýšený počet MDSC v cirkulaci a nádorovém mikroprostředí je asociován s imunosupresí a progresí nádorového onemocnění. U pacientů s kolorektálním karcinomem jsme detekovali zvýšený počet Mo-MDSC v periferní krvi v době diagnózy, což může být odrazem imunosupresivního mikroprostředí nádoru, a dále je nutné vyhodnotit jejich počet v kontextu s vývojem onemocnění. Rekombinantní růstové faktory granulopoézy zvyšují počet MDSC v cirkulaci a vliv tohoto aspektu na prognózu nádorového onemocnění je potřeba dále objasnit.

Klíčová slova:
myeloidní supresorové buňky – kolorektální karcinom – karcinom prsu – imunologie – imunosuprese – G-CSF

Úvod

Myeloidní supresorové buňky (myeloid-derived suppressor cells – MDSC) jsou heterogenní populací multipotentních progenitorových buněk myeloidního původu se sníženou funkcí diferenciace ve zralé myeloidní buňky. Nejvíce prostudovanou funkcí MDSC je útlum imunitní reakce, kde se fyziologicky předpokládá jejich úloha v regulaci nadměrné imunitní odpovědi. V patofyziologii nádorových onemocnění pak patří mezi buňky zodpovědné za únik nádoru imunitnímu dohledu hostitele. Nádorový růst a metastazování však podporují i jinými mechanizmy [1,2]. Nádorové metastazovaní MDSC podporují produkcí proteáz, které umožňují invazivitu nádoru a přestup nádorových buněk do cévního řečiště. V cévním řečišti jsou pak nádorové buňky chráněny před rozpoznáním imunitními buňkami tvorbou agregátů s MDSC a krevními destičkami. Nádorovou angiogenezi MDSC stimulují produkcí růstových faktorů a cytokinů, ale také jako buňky schopné diferencovat v endoteliální prekurzorové buňky (EPC) či makrofágy asociované s nádorem (TAM) [1,2].

Studie prokazují zvýšený výskyt MDSC u nádorových onemocnění nejen v okolí nádoru, ale také v periferní krvi, což pozitivně koreluje se špatnou prognózou a mortalitou a naopak negativně koreluje s výskytem a funkcí T lymfocytů v periferní krvi [3–5].

Jedny z významných endogenních faktorů, které regulují proliferaci MDSC a jejich mobilizaci do místa zánětu/nádoru, jsou růstové faktory granulocytů a makrofágů (G-CSF, GM-CSF) [6].

Membránové markery lidských MDSC jsou znaky myeloidních buněk CD11b a CD33, naopak postrádají nebo jen nízce exprimují HLA-Dr a dle exprese znaků CD15 nebo CD14 je lze rozlišit na skupinu granulocytárních (Gr-MDSC) a monocytárních (Mo-MDSC) MDSC. Gr-MDSC se vyznačují zejména produkcí arginázy 1 a volných kyslíkových radikálů, zatímco Mo-MDSC produkují oxid dusnatý. Takto, ale i jinými mechanizmy, MDSC ovlivňují jednotlivé subpopulace imunitních buněk [1,2].

Soubor pacientů a metody

Zastoupení Mo-MDSC v periferní krvi jsme stanovili na průtokovém cytometru Navios (Beckman Coulter) jako CD45⁺ leukocyty s imunofenotypem CD11b⁺CD33⁺HLA-Dr^low/–CD14⁺.

Relativní a absolutní počet cirkulujících Mo-MDSC jsme stanovili u 1. kontrolní populace 61 osob bez nádorového onemocnění (30 mužů ve věku 28–75 let a 31 žen ve věku 23–68 let), 2. u 39 pacientek se zhoubným nádorem prsu během léčby onemocnění (ve věku 33–84 let) a 3. u 52 pacientů s kolorektálním karcinomem (colorectal cancer – CRC) v době stanovení diagnózy a během 6měsíčního follow-up (29 můžu ve věku 31–81 let a 23 žen ve věku 33–83 let). U pacientek s karcinomem prsu byl zhodnocen vliv podání rekombinantních růstových faktorů granulopoézy (G-CSF) na počet cirkulujících Mo-MDSC. U pacientů s CRC byl počet Mo-MDSC korelován s klinicko-patologickým stadiem, lokalizací primárního nádoru (kolon vs. rektum), umístěním (levostranné vs. pravostranné) a mikrosatelitovou nestabilitou (MSI vs. MSI-high). Vyšetření byla provedena proti podepsanému informovanému souhlasu.

Statistické vyhodnocení rozdílů v zastoupení Mo-MDSC bylo provedeno za využití neparametrického Mann-Whitneyova U testu a Wilcoxonova párového testu pro srovnání párových dat.

Výsledky

Průměrný počet Mo-MDSC v kontrolní populaci byl 1,09 % z celkových leukocytů, tj. 0,073 × 10⁹/l a nebyl závislý na pohlaví a věku. U pacientek s karcinomem prsu byl průměrný počet cirkulujících Mo-MDSC významně vyšší ve srovnání s kontrolní populací: 3,57 % a 0,229 × 10⁹/l (p < 0,001). Vzhledem k předpokládanému vlivu aplikace rekombinantních růstových faktorů (G-CSF) na zvýšenou produkci Mo-MDSC a jejich vyplavování z kostní dřeně jsme počet cirkulujících Mo-MDSC zhodnotili také pouze u těch pacientek, u nichž nebyl tento typ podpůrné terapie aplikován. V této skupině byla průměrná hodnota cirkulujících Mo-MDSC ve srovnání s kontrolní populací také zvýšená: 3,71 % a 0,217 × 10⁹/l (p = 0,032). Pro zhodnocení vlivu aplikace rekombinantního G-CSF na počet Mo-MDSC v periferní krvi jsme u pěti pacientek stanovili počet cirkulujících Mo-MDSC před a 2–7 dní po podání růstových faktorů granulopoézy, kdy jsme pozorovali významný nárůst počtu Mo-MDSC v cirkulaci (p = 0,043) (graf 1).

**Graf 1. Vliv rekombinantního G-CSF na počet Mo-MDSC v periferní krvi.**
Počet cirkulujících Mo-MDSC byl vyšetřen u pěti pacientek s karcinomem prsu před a 2–7 dní po podání G-CSF, kdy počet cirkulujících Mo-MDSC významně vzrůstá (p = 0,043).

Pacienti s CRC v době stanovení diagnózy (stadium 0–IV) měli vyšší průměrný počet cirkulujících Mo-MDSC ve srovnání s kontrolní populací: 1,71 % a 0,125 × 10⁹/l (p = 0,003) (graf 2). Na tomto souboru jsme neprokázali korelaci relativního či absolutního počtu Mo-MDSC s klinicko-patologickým stadiem, lokalizací nádoru (kolon vs. rektum), umístěním (levostranné vs. pravostranné) a MSI.

**Graf 2. Počet cirkulujících Mo-MDSC u kontrolní populace a pacientů s CRC.**
U pacientů s CRC (dg. C18–C20) v době stanovení diagnózy lze pozorovat zvýšený počet Mo-MDSC v periferní krvi ve srovnání s kontrolní populací (dg. Z129) (p = 0,003).

Diskuze

Současný výzkum MDSC u nádorových onemocnění je zaměřen zejména na jejich využití jako biomarkerů nádorové progrese a léčebné odpovědi, ale také jako terapeutického cíle. V naší studii jsme detekovali zvýšený počet cirkulujících Mo-MDSC u pacientek s karcinomem prsu a pacientů s CRC v době stanovení jejich diagnózy, což pravděpodobně odpovídá imunosupresivnímu působení nádorového mikroprostředí. Zvýšený výskyt MDSC u nádorových onemocnění, ať už v mikroprostředí nádoru či v cirkulaci, byl popsán u různých typů nádorů, kde koreloval s progresí a mortalitou [3–5]. V naší skupině pacientů s CRC tedy bude dále nutné zhodnotit zastoupení a dynamiku cirkulujících MDSC v kontextu s vývojem onemocnění. Během 6měsíčního sledování 19 pacientů s CRC pozorovali nárůst počtu Mo-MDSC u 74 %, snížení u 11 % a stacionární nález u 16 % pacientů.

U onkologických pacientů je podáván rekombinantní G-CSF (např. filgrastim) ke zkrácení trvání neutropenie po podání chemoterapie, což může vést k vyplavování MDSC do periferní krve [6,7]. Vliv podání rekombinantních růstových faktorů granulopoézy na zvýšení počtu cirkulujících Mo-MDSC potvrdila i naše měření. Zde vyvstává otázka, zda růstové faktory granulopoézy nezhoršují prognózu onkologického onemocnění. Publikované studie nedávají na tuto otázku jasnou odpověď. Na myších modelech byla v některých studiích prokázána zvýšená progrese různých typů nádorů po podání rekombinacích růstových faktorů [8,9]. Studie u pacientek s karcinomem prsu uvádí zvýšené přežití po adjuvantním podání G-CSF [10]. Předpokládá se také, že úloha G-CSF a GM-CSF v regulaci nádorového růstu je odlišná [9].

Vzhledem ke svým imunoregulačním vlastnostem jsou MDSC studovány i z hlediska vlivu na účinek protinádorové imunoterapie. U pacientů s maligním melanomem počet cirkulujících Mo-MDSC před léčbou negativně koreloval s odpovědí na léčbu anti-CTLA-4 ipilimumabem [11]. Studována je souvislost angiogenního působení MDSC a vzniku rezistence k anti-angiogenní terapii. Jedním z navržených mechanizmů vzniku rezistence k tyrozinkinázovému inhibitoru sunitinibu u pacientů s renálním karcinomem je zvýšený počet intratumorálních MDSC doprovázený zvýšenou expresí angiogenních faktorů MMP-9, MMP-8 a IL-8 [12]. Byla popsána i souvislost mezi zvýšeným počtem MDSC a sníženou odpovědí na chemoterapii [6]. Znalost pronádorového působení MDSC vedla ke studiu možnosti využití MDSC jako terapeutického cíle [13].

Závěr

Zvýšený počet MDSC v periferní krvi a nádorovém mikroprostředí je asociován s imunosupresí a progresí nádorového onemocnění. U pacientů s CRC jsme v době diagnózy detekovali zvýšený počet MDSC v periferní krvi, což může být odraz imunosupresivního nádorového mikroprostředí. Dynamika počtu MDSC však musí být dále vyhodnocena v kontextu s vývojem nádorového onemocnění. Rekombinantní růstové faktory granulopoézy zvyšují počet MDSC v cirkulaci a vliv tohoto aspektu na prognózu nádorového onemocnění je potřeba dále objasnit.

Práce byla podpořena MŠMT cestou NPU I (LO1413), grantem AZV 16-31966A a MZ DRO 00209805.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

doc. RNDr. Lenka Zdražilová Dubská, Ph.D.

Oddělení laboratorní medicíny

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: dubska@mou.cz

Obdrženo: 11. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017

Zdroje

1. Marvel D, Gabrilovich DI. Myeloid-derived suppressor cells in the tumor microenvironment: expect the unexpected. J Clin Invest 2015; 125 (9): 3356–3364. doi: 10.1172/JCI80005.

2. Talmadge JE, Gabrilovich DI. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer 2013; 13 (10): 739–752. doi: 10.1038/nrc3581.

3. Yu J, Du W, Yan F et al. Myeloid-derived suppressor cells suppress antitumor immune responses through IDO expression and correlate with lymph node metastasis in patients with breast cancer. J Immunol 2013; 190 (7): 3783–3797. doi: 10.4049/jimmunol.1201449.

4. OuYang LY, WU XJ, Ye SB et al. Tumor-induced myeloid-derived suppressor cells promote tumor progression through oxidative metabolism in human colorectal cancer. J Transl Med 2015; 13: 47. doi: 10.1186/s12967-015-0410-7.

5. Solito S, Marigo I, Pinton L et al. Myeloid-derived suppressor cell heterogeneity in human cancers. Ann N Y Acad Sci 2014; 1319 (1): 47–65. doi: 10.1111/nyas.12 469.

6. Shojaei F, Wu X, Qu X et al. G-CSF-initiated myeloid cell mobilization and angiogenesis mediate tumor refractoriness to anti-VEGF therapy in mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106 (16): 6742–6747. doi: 10.1073/pnas.0902280106.

7. Li W, Zhang X, Chen Y et al. G-CSF is a key modulator of MDSC and could be a potential therapeutic target in colitis-associated colorectal cancers. Protein Cell 2016; 7 (2): 130–140. doi: 10.1007/s13238-015-2.

8. Aliper AM, Frieden-Korovkina VP, Buzdin A et al. A role for G-CSF and GM-CSF in nonmyeloid cancers. Cancer Med 2014; 3 (4): 737–746. doi: 10.1002/cam4. 239.

9. Kowanetz M, Wu X, Lee J et al. Granulocyte-colony stimulating factor promotes lung metastasis through mobilization of Ly6G+Ly6C+ granulocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107 (50): 21248–21255. doi: 10.1073/pnas.1015855107.

10. Altundag K, Altundag O, Elkiran ET et al. Addition of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) to adjuvant treatment may increase survival in patients with operable breast cancer: interaction of G-CSF with dormant micrometastatic breast cancer cells. Med Hypotheses 2004; 63 (1): 56–58.

11. Meyer C, Cagnon L, Costa-Nunes CM et al. Frequencies of circulating MDSC correlate with clinical outcome of melanoma patients treated with ipilimumab. Cancer Immunol Immunother 2014; 63 (3): 247–257. doi: 10.1007/s00262-013-1508-5.

12. Finke J, Ko J, Rini B et al. MDSC as a mechanism of tumor escape from Sunitinib mediated anti-angiogenic therapy. Int immunopharmacol 2011; 11 (7): 856–861. doi: 10.1016/j.intimp.2011.01.030.

13. Wesolowski R, Markowitz J, Carson W 3rd. Myeloid derived suppressor cells – a new therapeutic target in the treatment of cancer. J Immunother Cancer 2013; 1 (1): 10. doi: 10.1186/2051-1426-1-10.