Naděje a úskalí molekulární klasifikace karcinomu prsu

Hopes and pitfalls of the molecular classification of breast cancer

Traditional histopathological diagnosis of breast cancer has been extended in recent years through the results of additional methods. Today, the results of the detection of hormone receptors, HER-2/neu, and Ki67 antigen are thus an integral part of the histopathological diagnosis. A critical factor for the success of these tests is the fulfillment of pre-analytical phase conditions - i.e. optimal fixation, as well as taking into account the heterogeneous nature of the neoplastic population.

In addition to the above-mentioned markers - which have become a routine practice in recent years, there are many efforts to include the molecular characteristics of tumors both in tumor classification as well as in the prediction of results of cancer treatment. Most of the work is based on the use of gene expression profiles. On the basis of the detection of increased or decreased expression of a large number of genes, it is possible to find a set of multiple genes correlating with the biological behavior of the tumor. Using this approach, four basic subgroups of breast cancer have been identified - luminal, basal-like, HER-2 enriched and normal gland-like. Over the course of time, the number of molecular categories has expanded - originally a homogenous group of luminal cancers has been subclassified into the luminal A, B and C. Also within basal-like carcinomas additional subgroups have been identified. However, the results of studies dealing with the analysis of gene expression profiles suggest that our understanding of the biology of breast cancer is far from being complete. The individual categories are defined differently in various publications and thus the comparison of the results of these studies is very difficult. Another approach for the molecular classification of breast cancer is the immunohistochemical detection of various proteins used as a surrogate marker instead of the detection of the mRNA of individual genes. The advantage of this approach is the possibility to use even archive material, as well as much lower costs. On the other hand, its main limitation is the inability of parallel detection of thousands of markers, unlike in genomic profiling.

The results of molecular classification are, however, not fundamentally surprising. The fact that breast cancer tumor stem cells can differentiate towards myoepithelial (or basal) and luminal cells has been known for a long time. These two lines of differentiation are - among others - characterized by differential expression of cytoskeletal proteins as well as of other molecules. These findings have been confirmed by the results of molecular studies - either those based on gene expression profiling or immunohistochemical ones. Research results in gene expression profiling have relatively quickly translated into clinical practice. At present, several commercially available certified tests serve as a complementary source of information for decisions about clinical treatment.

Keywords:
breast cancer – luminal – basal-like – triple negative – predictive and prognostic markers – molecular classification – gene expression profiles

Autoři: Aleš Ryška; Eva Hovorková; Folakemi Sobande; Tomáš Rozkoš; Jan Laco; Helena Hornychová
Působiště autorů: Fingerlandův ústav patologie LF UK a FN, Hradec Králové
Vyšlo v časopise: Čes.-slov. Patol., 51, 2015, No. 1, p. 26-32
Kategorie: Přehledový článek

Souhrn

Tradiční histopatologická diagnostika karcinomu prsu se v posledních letech rozšířila o výsledky dalších metod doplňujících morfologické zhodnocení nádoru. Nedílnou součástí histopatologické diagnózy jsou tak dnes výsledky vyšetření exprese hormonálních receptorů, proteinu HER-2/neu a proliferačního antigenu Ki67. Kritickým momentem pro korektní využití těchto vyšetření je dodržení podmínek preanalytické fáze - tj. optimální způsob fixace a dále zohlednění heterogenního charakteru nádorové populace.

Kromě této dnes již rutinní praxe se v posledních letech rozšiřují snahy o zohlednění molekulárních charakteristik nádorů a jejich využití v klasifikaci nádorů a v predikci úspěšnosti protinádorové léčby. Většina prací se opírá o stanovení tzv. genových expresních profilů. Na základě průkazu zvýšené či snížené exprese velkého počtu genů je možné najít sadu několika genů, která nejlépe koreluje s biologickými vlastnostmi nádoru. Takto bylo možné identifikovat 4 základní skupiny karcinomů - luminální, bazální (basal-like), HER-2 pozitivní (HER-2 enriched) a podobné normální prsní žláze (normal-like). Počet kategorií se následně rozšířil - původně jednotná skupina luminálních karcinomů se rozpadla na luminální A a B, případně i luminální C. Také v rámci bazálních karcinomů byly nalezeny další podskupiny. Výsledky studií zabývajících se analýzou genových expresních profilů nádorů ale ukazují, že naše porozumění biologii karcinomu prsu je teprve na začátku. V různých publikacích jsou jednotlivé kategorie různě definovány, a proto je srovnávání jejich výsledků velmi problematické. Další možností molekulární klasifikace karcinomů prsu je imunohistochemická analýza exprese jednotlivých proteinů, používaných jako náhradní parametr (surrogate marker) místo detekce mRNA jednotlivých genů. Výhodou je možnost využití archivního parafinového materiálu a řádově nižší cena. Limitací je naopak nemožnost paralelní detekce tisíců markerů, jak je tomu u genomického profilování. Výsledky molekulárně klasifikačních studií však nejsou zcela zásadně překvapivé, již z minulosti je známo, že nádorová kmenová buňka u karcinomu prsu se může diferencovat směrem myoepiteliálním (neboli bazálním) a luminálním. Oba směry se liší mj. rozdílnou expresí cytoskeletálních proteinů a dalších molekul. Molekulární klasifikace karcinomů prsu - ať opírající se o různé sady genových expresních profilů nebo o extenzivní imunohistochemické vyšetření řady markerů - výsledky těchto prvních morfologických studií potvrdily. Výsledky výzkumu v oblasti genových expresních profilů se nicméně poměrně rychle promítly do klinické praxe. V současné době je komerčně dostupných několik certifikovaných testů sloužících jako doplňková informace při klinickém rozhodování o léčbě.

Klíčová slova:
karcinom prsu – luminální – bazální – triple negativní – prediktivní a prognostické markery – molekulární klasifikace – genové expresní profily

Diagnostika a nové léčebné metody u některých solidních nádorů velmi názorně ilustrují, jak obrovský skok udělala medicína v posledních 15 letech. Pro kvalifikované rozhodování o volbě optimální onkologické léčby je na patologa kladeno stále více požadavků. Doby, kdy postačovalo stanovení vlastní diagnózy, grade a TNM stádia jsou nenávratnou minulostí a součástí vyšetření mnoha různých nádorů je dnes stanovení řady dalších parametrů - morfologických, imunohistochemických i molekulárně-genetických, které slouží onkologovi jako prognostické a zejména prediktivní markery pro volbu optimální systémové léčby.

Kromě toho nové poznatky zejména z oblasti molekulární patologie umožnily získat lepší představu o etiopatogenezi nádorů, příčinách rozdílů v jejich biologickém chování a odpovědi na různé druhy terapie, a pomáhají v rozhodování, který typ systémové léčby je pro daného pacienta optimální, tedy s nejlepší nadějí na pozitivní efekt a současně s minimalizací rizika vzniku nežádoucích účinků. Na příkladu karcinomu prsu lze velmi dobře ilustrovat výhody i rizika současných postupů zahrnujících vedle tradičního morfologického hodnocení nádorů také vyšetřování pomocí imunohistochemie, in situ hybridizace či molekulárně-genetických postupů.

KLASICKÁ HISTOPATOLOGICKÁ DIAGNOSTIKA – VÝHODY A LIMITACE

Tradiční histopatologická diagnostika karcinomu prsu využívala - a stále využívá - posouzení vzhledu a charakteru růstu nádorových buněk a v histopatologickém závěru na základě zhodnocení těchto parametrů figuruje histologický typ nádoru (duktální, lobulární, mucinózní, tubulární, atd.), charakter růstu nádoru (in situ, invazivní), histopatologický stupeň diferenciace (grade 1 – 3), vztah nádoru k cévám (lymfangioinvaze, invaze krevních cév) a k okolním strukturám (kůže, pektorální svaly). Na základě syntézy těchto údajů je vytvořena „tradiční“ histopatologická diagnóza.

Nicméně, pouhé morfologické zhodnocení není schopno poskytnout všechny relevantní informace, které jsou nutné pro volbu optimální léčebné strategie. Z morfologie není možné předpovědět předpokládanou odpověď na některé (zejména cílené) typy léčby, jako jsou blokáda hormonální osy či HER-2/neu signální dráhy. Z tohoto důvodu jsou dnes nedílnou součástí histopatologické diagnózy rovněž výsledky vyšetření exprese některých prognostických a prediktivních markerů rozhodujících o biologickém chování nádoru a odpovědi na léčbu - jmenovitě hormonálních receptorů (estrogenových - ER a progesteronových - PR), proteinu HER-2/neu a proliferačního antigenu Ki67.

HORMONÁLNÍ RECEPTORY

„Nejstarším“ prediktivním markerem u karcinomu prsu (ale i v patologii solidních nádorů obecně) je průkaz exprese estrogenových a později i progesteronových receptorů. Přítomnost ER byla v karcinomu prsu poprvé prokázána již v 50. letech minulého století, od 70. let pak byla přítomnost ER využívána pro predikci odpovědi na hormonální léčbu (1). ER byly v minulosti detekovány pomocí biochemických metod z homogenizované nativní tkáně, ale s nástupem imunohistochemie se zlatým standardem jejich stanovení stalo právě imunohistochemické vyšetření z parafinového materiálu. Jeho výhodou je možnost rutinního provádění (je využita stejná tkáň, jako pro běžné histologické vyšetření), nízké náklady, relativně snadné provedení umožňující vyšetřování v široké síti běžných laboratoří patologie a v neposlední řadě také možnost korelace mikroskopického nálezu s výsledkem průkazu exprese receptorů. Na rozdíl od biochemického vyšetření, které bylo závislé na relativním zastoupení nádorových buněk ve tkáni a v případě hypocelulárních nádorů tak mohlo podávat falešně negativní výsledek (a v případě hormonálně negativního karcinomu prorůstajícího do okolní normální žlázy s expresí ER i PR naopak výsledek falešně pozitivní), umožňuje imunohistochemie mikroskopickou verifikaci typu buněk, které hormonální receptory exprimují. Druhou stranou mince imunohistochemického stanovení exprese ER a PR (toto ale platí i pro všechny další markery) je velká citlivost metody na dodržení podmínek tzv. preanalytické fáze vyšetření - tj. na způsob zacházení s nádorovou tkání před vlastním vyšetřením. Kritickým momentem je zejména optimální způsob fixace. Platí, že tkáň musí být fixována okamžitě po odběru, množství fixativa (takřka ve 100 % případů formalín) musí být dostatečné, aby byla umožněná rychlá difúze až do centra vzorku, délka doby fixace by se neměla být kratší než 6 hodin a nepřesáhnout výrazně 24 hodin. Nedodržení těchto vcelku jednoduchých podmínek může mít za následek znehodnocení tkáně, kdy vyšetření je následně výrazně omezeno nebo v některých případech dokonce zcela znemožněno (2).

Expresi ER lze prokázat u zhruba 80 % invazivních karcinomů prsu, u více než poloviny z nich jsou exprimovány rovněž PR (3,4). Přítomnost PR je přitom závislá na funkční signální dráze regulované ER, nádory s ER+/PR- fenotypem proto hůře odpovídají na antihormonální terapii.

Vzhledem k výše řečenému také není překvapivé, že v praxi se prakticky nevyskytují nádory, které by vykazovaly expresi PR, přitom však byly ER negativní (ER-/PR+). V případě takového nálezu je vždy třeba v první řadě pátrat po tom, zda bylo vyšetření receptorů provedeno správně, zda je ve tkáni pozitivní vnitřní kontrola, případně vyšetření zopakovat z jiného bloku. Při rigorózním dodržení všech podmínek jsou nádory ER-/PR+ absolutní raritou (5).

Pro spolehlivé hodnocení ER a PR proto musí mít laboratoř své metody správně a trvale validovány tak, aby se zabránilo falešně negativním či pozitivním výsledkům (6).

HER2

Protein HER-2/neu (dále jen HER2), který byl poprvé popsán v roce 1982, je produktem přepisu onkogenu c-erbB-2 lokalizovaného na dlouhém raménku 17. chromozomu (17q21). Tento protein o molekulové hmotnosti 185kd je zástupcem rodiny receptorů pro epidermální růstový faktor (EGFR). Kromě HER2 patří do této skupiny také receptory HER1 (EGFR), HER3 a HER4. Tyto 4 molekuly jsou si do velké míry podobné – všechny obsahují extracelulární doménu, na kterou se váže ligand daný receptor aktivující, transmembránovou doménu a intracelulární doménu, která se vyznačuje tyrozinkinázovou aktivitou, díky které je nastartována signální kaskáda vedoucí ke konečnému biologickému efektu (7). Na samém počátku signální dráhy je moment aktivace receptoru ligandem, který vede k procesu dimerizace - homodimerizace, či v případě vazby na jiný receptor z rodiny HER, heterodimerizace. Jednotlivé molekuly skupiny HER se od sebe poněkud liší - právě HER2 je jediným zástupcem, který není přímo aktivován svým ligandem (má „necitlivou“ či „slepou“ svou extracelulární doménu) a podílí se tak na procesu dimerizace spontánně a z celé skupiny HER receptorů nejochotněji. Následná fosforylace a aktivace signální dráhy vede ke zvýšené proliferaci, zablokování apoptózy, zvýšené vaskularizaci nádoru a vyššímu metastatickému potenciálu. Proto je HER2 u karcinomu prsu považován za jednoznačně nepříznivý prognostický faktor (8).

Příčinou nadměrné exprese HER2, vyskytující se u karcinomu prsu v naší populaci asi v 12 - 15 %, je takřka vždy amplifikace genu c-erbB-2 (9). Tato pozitivita HER2 – ať již prokázaná imunohistochemicky (IHC) detekcí proteinu na buněčné membráně, nebo in situ hybridizací (ISH) pomocí detekce amplifikace, bývá významně častější zejména u nádorů nízce diferencovaných, častěji u karcinomů duktálních než lobulárních (10).

První publikace zabývající se detekcí HER2 pozitivního karcinomu prsu udávaly relativní zastoupení mezi 20 a 25 %, případně až u 30 % nádorů (11-14). Dle analýzy českého histologického registru karcinomu prsu (MAGISTER) představovaly v roce 2013 HER2+ nádory 13,5 % všech nově diagnostikovaných invazivních karcinomů, pokud byly nádory hodnoceny podle původních kritérií z r. 2007 (15), resp. 14,1%, pokud byla použita nově přijatá kritéria z roku 2013 (9). Tento poměrně dramatický rozdíl oproti datům z původních prací má několik důvodů. Kromě toho, že v počátku byly převážně publikovány studie u předem selektovaných pacientek s metastatickým onemocněním (kde je zastoupení HER2+ nádorů vyšší vzhledem k jejich větší agresivitě), dochází k dlouhodobému trvalému poklesu relativního zastoupení HER2+ karcinomů prsu v populaci. Důvodů je opět několik:

široké používání hormonální terapie v minulosti vedlo k nárůstu incidence zejména luminálních (HER2 negativních) karcinomů u starších žen. Toto dokumentuje např. finská studie, která demonstruje, že zatímco absolutní počet všech karcinomů v posledních 20 letech ve Finsku trvale roste, zůstává počet HER2 pozitivních karcinomů prakticky neměnný a jejich relativní zastoupení proto trvale klesá (16).
zastoupení HER pozitivních karcinomů prsu je různé v různých věkových skupinách. Zatímco u žen mladších 40 let se vyskytuje relativně velmi často (až ve 40 % případů), u žen nad 50 let je to jen u méně než 10 % nádorů (17). Většina karcinomů prsu v ČR je identifikována screeningem u asymptomatické populace. Protože screening již určitou dobu úspěšně běží, byly u mladších žen, které jsou již ve screeningu déle, zachyceny karcinomy v časnějším věku, zatímco nyní se zachycují více nádory u starších žen – opět spíše luminální. Obdobný efekt byl pozorován i v USA v rozsáhlém souboru mammograficky detekovaných karcinomů (18) i pacientek s již metastatickým onemocněním (19).
Zastoupení HER2 pozitivních (a také triple-negativních) nádorů v populaci se liší podle jejího rasového složení. HER2 pozitivní nádory byly popsány jako podstatně častější např. v arabské či asijské populaci (20), triple-negativní karcinomy jsou častější v afroamerické (21,22) či latinsko-americké populaci (23,24), i když některé práce ukazují, že rozdíly mohou být zapřičiněny i rozdíly v socio-ekonomických faktorech (25,26).

Jak bylo již výše řečeno, až do 90. let minulého století byla zvýšená exprese HER2 považována pouze za negativní prognostický faktor (8). Avšak se zavedením trastuzumabu do léčby se HER2 stal ze znaku čistě prognostického rovněž markerem prediktivním. Jeho vyšetřování se ukázalo být zcela zásadním pro selekci těch pacientek, které jsou vhodné pro léčbu trastuzumabem (7).

Ki-67

Vyšetření proliferační aktivity pomocí tohoto markeru je v dnešní době považováno za jeden z klíčových faktorů při rozhodování o volbě terapie, Ki-67 je prokazatelně nejen markerem prognostickým (nádory s vyšším Ki-67 indexem se chovají agresivněji), ale rovněž prediktivním – lepší odpověď na chemoterapii i hormonální léčbu lze předpokládat u nádorů s vyšší proliferací (27). Přitom proliferační aktivita nádoru (potažmo exprese Ki-67) je velmi nehomogenní, s maximem na periferii nádorového ložiska (28). Publikované studie ukazují, že konkordance ve stanovení Ki-67 je i mezi experty na mamární patologii nízká, a to zejména u nádorů středně diferencovaných (G2), kde má přitom správné zhodnocení proliferační aktivity největší význam při klinickém rozhodování (29). Pokud k metodickým úskalím, jež jsou vlastní hodnocení tohoto parametru jako takového (dodržení všech požadavků preanalytické fáze, volba vhodné imunohistochemické metody, zkušenost při vyhodnocení), přibude ještě další faktor nejistoty způsobený limitovanou velikostí vzorku, lze brát výpovědní hodnotu Ki-67 indexu jako pouze hrubě orientační a nelze do tohoto parametru vkládat nepřiměřená očekávání. V tomto kontextu působí jako velmi naivní snaha o stanovení jedné plošně platné prahové hodnoty (20%) na odlišení nízce a vysoce proliferujících nádorů, tak jak k tomu došlo na letošním kongresu v St. Gallen (30). Při znalosti úskalí, která provázejí stanovení Ki-67 indexu, je třeba si uvědomit, že v době medicíny založené na důkazech se biologický potenciál nádoru opravdu nedá stanovit na základě arbitrární hodnoty cut-off určené hlasováním expertů.

MOLEKULÁRNÍ KLASIFIKACE KARCINOMU PRSU

První práce zabývající se možnostmi molekulární klasifikace se metodicky opíraly o studium ztráty heterozygozity (LOH) a metodu komparativní genomové hybridizace (CGH). Umožnily na základě průkazu ztráty, zisku či amplifikací úseků DNA pouze stratifikaci nádorů do nízce a vysoce agresivních podskupin (31-33). Teprve v roce 2000 byla publikována průlomová práce popisující využití genových mikroarrayí pro stanovení tzv. genových expresních profilů (34). Na základě průkazu zvýšené či snížené exprese více než 8000 genů a velmi sofistikované statistické analýzy (postupu označovaného jako data mining) hledala takovou sadu genů, která by nejlépe korelovala s biologickými vlastnostmi nádoru byly identifikovány celkem 4 základní skupiny karcinomů – luminální, bazální (basal-like), HER2-pozitivní (HER-2 enriched) a podobné normální prsní žláze (normal-like). Je však třeba připomenout, že tato studie měla zásadní limitace – celý soubor tvořilo pouhých 42 případů, z nichž jen 38 byly invazivní karcinomy (zbývající 4 případy byly duktální karcinom in situ, fibroadenom a vzorky normální prsní žlázy). Autoři proto upozorňují, že jsme ještě velmi daleko od získání kompletního obrázku o heterogenitě karcinomů prsu a předpovídají, že analýza většího souboru by pravděpodobně dokázala identifikovat ještě vyšší počet molekulárních podtypů nádorů (34). Následovala celá řada dalších studií, které se lišily nejen počtem a spektrem analyzovaných nádorů, ale rovněž v metodice, jakým byl expresní profil zjišťován. Studie nizozemských autorů (35) následně identifikovala na větším souboru 117 N0 karcinomů prsu u mladších žen (<50 let) sadu 70 genů, které dokázaly zařadit pacientky do dvou prognosticky naprosto odlišných skupin – statistická významnost genetického profilu předčila kterýkoli z tradičních klinicko-patologických parametrů. Prognostický význam této genové sady byl potvrzen i v následující práci, která analyzovala předem neselektovanou populaci 295 karcinomů prsu (36).

Další práce dále rozšířily počet kategorií – původně jednotná skupina luminálních karcinomů se rozpadla na 2 – luminální A a B (37), případně na 3 – luminální A, B a C (38). Také v rámci skupiny bazálních karcinomů byly nalezeny další podskupiny (38).

Výsledky studií zabývajících se analýzou genových expresních profilů nádorů ukázaly, že naše porozumění biologii karcinomu prsu je teprve na začátku. Přes řadu diskrepancí a rozporných závěrů z těchto studií poměrně konsenzuálně vyplývá, že karcinomy prsu tvoří několik skupin, které se od sebe navzájem signifikantně liší svojí molekulární patogenezí a biologickým chováním (jak přirozeným, tak pokud jde o odpověď na jednotlivé typy systémové terapie). Dva základní směry, kterými se může kmenová buňka diferencovat je směr myoepiteliální (neboli bazální) a směr luminální. Zatímco luminální buňky vykazují expresi některých typů cytoskeletálních proteinů (cytokeratiny 7, 8, 18, 19), myoepiteliální elementy exprimují markery bazálních buněk (cytokeratiny 5/6, 14, protein p63, hladkosvalový aktin, calponin apod.) (39-41). Kmenová buňka se může diferencovat nejen do obou zmíněných buněčných typů, ale v rámci benigních lézí (např. duktální hyperplázie) se lze setkat i s různými přechodnými stádii, kde lze v buňce prokázat dílčí charakteristiky obou pólů spektra (42,43).

Luminální A karcinomy jsou prakticky výlučně low grade, hormonálně dependentní (ER+ a zpravidla i PR+) s nízkou proliferační aktivitou, bez exprese HER2 a p53 (37, 38, 44, 45). Naproti tomu luminální B karcinomy jsou podstatně heterogennější skupinou – patří sem nádory obdobné karcinomům luminálním A, které však mají buď vyšší proliferační aktivitu (jsou grade 2 či vzácněji 3), a/nebo exprimující HER2 (18,46-49). Jejich biologické chování je tedy statisticky významně agresivnější (48, 50).

V průběhu času byla navržena celá řada dalších podskupin, na kterých však mezi jednotlivými studiemi neexistuje shoda, některé je vyčleňují samostatně (např. normal-like, luminal N, basal-like s alterací p53, basal-like s normálním p53, claudin-low, interferon-rich, apokrinní, atd.), jiné je zahrnují jako součást jedné z výše uvedených množin (1,40,49,51).

Další možností molekulární klasifikace karcinomů prsu je imunohistochemická analýza exprese jednotlivých proteinů, které jsou používány jako náhradní parametr (surrogate marker) místo detekce mRNA jednotlivých genů (46,51-53). Výhodou tohoto přístupu je možnost využití archivního parafinového materiálu, proteiny jsou podstatně stabilnější, než rychle degradující mRNA a v neposlední řadě je řádově nižší cena. Na druhou stranu je imunohistochemie zatížena celou řadou různých úskalí od demaskování antigenu přes detekci, amplifikaci signálu až po principiálně subjektivní interpretaci. Další zásadní limitací je nemožnost paralelní detekce tisíců markerů, jak je tomu u genomického profilování. Před zahájením studie musí být tedy předem rozhodnuto, které konkrétní markery budou v nádorech testovány. Přesto práce používající imunohistochemické analýzy přinesly výsledky, které jsou principiálně srovnatelné s molekulárně-genetickým profilováním (40,51,53,54).

Výsledky molekulárně klasifikačních studií však nejsou zcela zásadně překvapivé, neboť již v minulosti byla vyslovena hypotéza podpořená i imunofluorescenčními studiemi, která tvrdila, že kmenové buňky prsní žlázy, ze kterých mohou vznikat i karcinomy prsu, mají schopnost multidivergentní diferenciace (41). Molekulární klasifikace karcinomů prsu – ať opírající se o různé sady genových expresních profilů nebo o extenzivní imunohistochemické vyšetření řady markerů výsledky těchto prvních morfologických studií potvrdily.

Luminální buňky hrají stěžejní roli v produkci součástí mléka, proto jsou přímo ovlivňovány pohlavními hormony a exprimují ve svém jádře hormonální receptory, zatímco buňky bazální expresi těchto receptorů postrádají. Není tedy překvapivé, že jedním z hlavních znaků luminálních karcinomů je právě exprese ER a PR, zatímco karcinomy bazální spadají prakticky výhradně do kategorie tzv. triple negativních nádorů (tedy ER-, PR- a HER2-). Pro některé kategorie karcinomů prsu (typicky HER2 pozitivní) ale neexistuje protipól v oblasti benigních lézí a tento fenotyp je pozorován výhradně v rámci maligních nádorů.

Skupina triple-negativních karcinomů, často považovaná za paušálně prognosticky nepříznivou, je ve skutečnosti velmi heterogenní a zahrnuje jak případy skutečně vysoce agresivní (atypický medulární karcinom, metaplastický karcinom, dediferencované duktální či pleomorfní lobulární karcinomy), tak nádory s prognózou vynikající (např. adenoidně cystický karcinom) (39,55). Společným pro všechny triple-negativní karcinomy je fakt, že jedinou možností systémové léčby je chemoterapie. Odpověď na ni je však u jednotlivých případů rozdílná (56). Kategorie triple-negativních karcinomů je tak podstatně širší, než kategorie nádorů bazálních, byť jsou tyto pojmy často nesprávně používány jako synonyma (54,57).

Výsledky výzkumu v oblasti genových expresních profilů se poměrně rychle promítly do klinické praxe. V současné době je komerčně dostupných několik certifikovaných testů, které slouží jako doplňková informace při klinickém rozhodování o léčbě (58). Jednotlivé testy se liší počtem a spektrem genů, které jsou vyšetřovány – u testu OncotypeDX jde o 21 genů (59), u testu MammaPrint o 70 genů (60, 61). Dalším rozdílem je typ tkáně, kterou lze použít – zatímco testování pomocí OncotypeDX je možné provádět na parafinových bločcích, pro vyšetření MammaPrintem je nezbytné použít nefixovanou tkáň, což jistě limituje využití tohoto testu. Recentně však byla publikována práce, která ukazuje, že i pro tento test by bylo možné využívat s vysokou spolehlivostí fixovanou tkáň v parafinu (62). Spolehlivost molekulárně-genetické analýzy specializovanými testy je ohrožena důsledky neadekvátního zacházení s odebranou nádorovou tkání naprosto stejně, jako výše uvedené imunohistochemické vyšetření. Alfou a omegou pro získání validních informací z nádoru je dodržení rychlé a optimální fixace tkáně.

Důležité je si také uvědomit, že prognostický přínos komerčních testů je ověřený pouze pro určité podskupiny pacientek s karcinomem prsu. Jedná se o nádory hormonálně dependentní (ER+), HER2 negativní a bez uzlinových metastáz (60,63-65). I tato podskupina je však stále heterogenní a např. u nádorů silně hormonálně dependentních nemá použití OncotypeDX zásadnější přínos, neboť naprostá většina takových nádorů vykáže v testu nízké skóre rekurence (66).

Otázkou, která doposud zůstává ne zcela jednoznačně zodpovězena, tak zůstává význam provádění molekulární klasifikace v rutinní diagnostické praxi (67-69). Vysoce sofistikovanou a velmi nákladnou klasifikaci pomocí analýzy expresních profilů několika desítek genů lze v běžném životě velmi dobře nahradit imunohistochemickým vyšetřením několika málo klinicky relevantních markerů - ER, PR, Ki67, HER-2/neu (70). Tyto 4 hlavní znaky byly zahrnuty do tzv. IHC4 skóre (70,71). Výsledek tohoto vyšetření není sice plně ekvivalentní stanovení genového expresního profilu, pokud je však imunohistochemie provedena v dobře fungující laboratoři a z reprezentativního vzorku tkáně, postačují získané informace ve většině případů pro kvalifikované terapeutické rozhodnutí (70). Využití komerčních testů tak pravděpodobně zůstane limitováno na podmnožinu jasně klinicky definovaných případů se středním stupněm rizika dle standardních klinicko-patologických parametrů, kde je rozhodování o podání či nepodání adjuvantní chemoterapie velmi obtížné a i v dnešní době do značné míry arbitrární (69). U těchto případů lze očekávat přínos těchto testů pro finální klinické rozhodnutí (72-74).

Pro klinickou praxi všedního dne vyplývají ze studií zaměřených na molekulární klasifikaci karcinomu prsu některé závěry:

Jen naprosto výjimečně dochází k tomu, aby nádor původně spadající do jedné ze subkategorií „konvertoval“ v recidivě či metastáze do subkategorie jiné (33,75). To však neznamená, že se nádory během svého vývoje nijak nemění - je známo, že jak vzhledem k přirozenému vývoji s postupnou akumulací mutací v nádorových buňkách, tak i v důsledku terapeutického ovlivnění, dochází ke změnám v proliferační aktivitě (ta je po systémové léčbě výrazně nižší) (76), v rámci dediferenciace mohou nádory původně hormonálně dependentní ztrácet expresi hormonálních receptorů, apod. (75)
Důležitější, než zařazení nádoru do molekulární kategorie (např. luminální, bazální, apod.) je poskytnutí klinicky relevantní informace ohledně exprese markerů rozhodujících o volbě terapie. Tedy – pro onkologa je relevantní informací, že nádor je triple negativní (ER-/PR-/HER2-), nikoli že je nádor basal-like. Obdobně je důležitější, že nádor je hormonálně dependentní, bez exprese HER2 a s nízkou proliferační aktivitou, nikoli, že jde o nádor luminální A. Zatímco v některých případech (např. právě luminální A nádory) je klinická informace vyplývající z definice kategorie jednoznačná (prakticky neexistují jiné luminální A nádory, než low grade hormonálně dependentní, HER2 negativní), v jiných případech je zařazení dle molekulárního profilu bez dalších doplňujících informací zcela nedostatečné (luminální B karcinom může být jak HER2 pozitivní, tak HER2 negativní).
Je třeba mít stále na paměti technické a metodické limitace našich vyšetření. Jedním z nich může být heterogenita nádorové populace. V jejím důsledku může být vyšetření některých markerů v malých bioptických vzorcích (typicky core cut biopsie) a zařazení nádoru do jedné z terapeuticky relevantních kategorií nesprávné. Typickým příkladem může být detekce proliferačního antigenu Ki67, obdobně nehomogenní jako u proliferační aktivity je ale také exprese hormonálních receptorů v některých nádorech, více toto platí pro receptory progesteronové než pro estrogenní. Naproti tomu exprese HER-2/neu je podstatně více homogenní, i když i zde se lze ojediněle setkat s nádory s heterogenní populací neoplastických buněk. Proto je obecně doporučováno v případech, kde je to možné, v případě negativity některého markeru (ať již ER/PR či HER2) v bioptickém vzorku, zopakování vyšetření z definitivního resekátu.
Další limitací je pak kvalita tkáně, kterou máme pro vyšetření k dispozici. Jak nedostatečná tak inadekvátně dlouhá fixace může vést k falešně negativním výsledkům. Tato falešná negativita má naprosto zásadní dopad na osud nemocných. Např. z prognosticky příznivého hormonálně dependentního nádoru (ER+/PR+/HER2-) se kvůli falešné negativitě průkazu steroidních receptorů rázem stává prognosticky zpravidla nepříznivý karcinom triple negativní (ER-/PR-/HER2-)!

ZÁVĚR

Lze tedy konstatovat, že kvalifikovaně se rozhodnout o optimálním typu péče pro pacientku s karcinomem prsu je možné pouze tehdy, pokud je splněno několik základních podmínek. Na prvním místě musí fungovat kvalitní mezioborová spolupráce a zcela hladká komunikace, která zajistí přenos informací v plném rozsahu (tedy nikoli pouze „hodnotu“ ve výsledkovém protokolu, ale zasazení jednotlivých parametrů do celkového kontextu s vědomím si všech možných limitací vyšetření). Druhým nezbytným předpokladem je optimalizace zpracování nádorové tkáně jak na straně klinické (dodržení preanalytické fáze), tak na straně patologa (kontrola kvality práce laboratoře, validace všech použitých metod, používání certifikovaných kitů tam, kde je to možné). Třetím předpokladem je uvědomění si, že i přes všechen rozvoj moderních technologií a laboratorních metod, je patologie stále oborem do velké míry expert-dependentním, tedy zatíženým značnou mírou subjektivity.

PODĚKOVÁNÍ

Práce byla podpořena projekty PRVOUK P37/11, BBMRI LM2010004 a IGA MZ ČR NT 14150-3/2013.

Adresa pro korespondenci:

Prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D.

Fingerlandův ústav patologie LF UK a FN

Fakultní nemocnice

500 05 Hradec Králové

tel.: 495833748, fax: 495832004

Zdroje

1. Vuong D, Simpson PT, Green B, Cummings MC, Lakhani SR. Molecular classification of breast cancer. Virchows Arch 2014; 465(1): 1-14.

2. Bussolati G, Leonardo E. Technical pitfalls potentially affecting diagnoses in immunohistochemistry. J Clin Pathol 2008; 61(11): 1184-1192.

3. Anderson WF, Chatterjee N, Ershler WB, Brawley OW. Estrogen receptor breast cancer phenotypes in the Surveillance, Epidemiology, and End Results database. Breast Cancer Res Treat 2002; 76(1): 27-36.

4. Chu KC, Anderson WF. Rates for breast cancer characteristics by estrogen and progesterone receptor status in the major racial/ethnic groups. Breast Cancer Res Treat 2002; 74(3): 199-211.

5. Cserni G, Francz M, Kalman E, et al. Estrogen receptor negative and progesterone receptor positive breast carcinomas-how frequent are they? Pathol Oncol Res 2011; 17(3): 663-668.

6. Marchio C, Dowsett M, Reis-Filho JS. Revisiting the technical validation of tumour biomarker assays: how to open a Pandora’s box. BMC Med 2011; 9: 41.

7. Barros FF, Powe DG, Ellis IO, Green AR. Understanding the HER family in breast cancer: interaction with ligands, dimerization and treatments. Histopathology 2010; 56(5): 560-572.

8. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987; 235(4785): 177-182.

9. Wolff AC, Hammond ME, Hicks DG, et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol 2013; 31(31): 3997-4013.

10. Turashvili G, Bouchalova K, Bouchal J, Kolar Z. Expression of E-cadherin and c-erbB-2/HER-2/neu oncoprotein in high-grade breast cancer. Cesk Patol 2007; 43(3): 87-92.

11. Clark GM, McGuire WL. Follow-up study of HER-2/neu amplification in primary breast cancer. Cancer Res 1991; 51(3): 944-948.

12. Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ. Comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry for the evaluation of HER-2/neu in breast cancer. J Clin Oncol 1999; 17(7): 1974-1982.

13. Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ. HER-2/neu protein expression in breast cancer evaluated by immunohistochemistry. A study of interlaboratory agreement. Am J Clin Pathol 2000; 113(2): 251-258.

14. Pauletti G, Dandekar S, Rong H, et al. Assessment of methods for tissue-based detection of the HER-2/neu alteration in human breast cancer: a direct comparison of fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry. J Clin Oncol 2000; 18(21): 3651-3664.

15. Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol 2007; 25(1): 118-145.

16. Koninki K, Tanner M, Auvinen A, Isola J. HER-2 positive breast cancer: decreasing proportion but stable incidence in Finnish population from 1982 to 2005. Breast Cancer Res 2009; 11(3): R37.

17. Sobande F, Ryska A. Breast cancer in young women - lessons from an institutional review. Breast J 2014; 20(2): 216-218.

18. Tamimi RM, Baer HJ, Marotti J, et al. Comparison of molecular phenotypes of ductal carcinoma in situ and invasive breast cancer. Breast Cancer Res 2008; 10(4): R67.

19. Dawood S, Broglio K, Buzdar AU, Hortobagyi GN, Giordano SH. Prognosis of women with metastatic breast cancer by HER2 status and trastuzumab treatment: an institutional-based review. J Clin Oncol 2010; 28(1): 92-98.

20. Khoury T, Kanehira K, Wang D, et al. Breast carcinoma with amplified HER2: a gene expression signature specific for trastuzumab resistance and poor prognosis. Mod Pathol 2010; 23(10): 1364-1378.

21. Stead LA, Lash TL, Sobieraj JE, et al. Triple-negative breast cancers are increased in black women regardless of age or body mass index. Breast Cancer Res 2009; 11(2): R18.

22. McCormack VA, Joffe M, van den Berg E, et al. Breast cancer receptor status and stage at diagnosis in over 1,200 consecutive public hospital patients in Soweto, South Africa: a case series. Breast Cancer Res 2013; 15(5): R84.

23. Al-Kuraya K, Schraml P, Sheikh S, et al. Predominance of high-grade pathway in breast cancer development of Middle East women. Mod Pathol 2005; 18(7): 891-897.

24. Villarreal-Garza C, Aguila C, Magallanes-Hoyos MC, et al. Breast cancer in young women in Latin America: an unmet, growing burden. Oncologist 2013; 18(12): 1298-1306.

25. Giraldo-Jimenez MY, Cabanillas F, Negron V, et al. Triple negative breast cancer: a retrospective study of Hispanics residing in Puerto Rico. P R Health Sci J 2012; 31(2): 45-51.

26. Pacheco JM, Gao F, Bumb C, Ellis MJ, Ma CX. Racial differences in outcomes of triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2013; 138(1): 281-289.

27. Viale G, Giobbie-Hurder A, Regan MM, et al. Prognostic and predictive value of centrally reviewed Ki-67 labeling index in postmenopausal women with endocrine-responsive breast cancer: results from Breast International Group Trial 1-98 comparing adjuvant tamoxifen with letrozole. J Clin Oncol 2008; 26(34): 5569-5575.

28. Dowsett M, Nielsen TO, A’Hern R, et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst 2011; 103(22): 1656-1664.

29. Varga Z, Diebold J, Dommann-Scherrer C, et al. How reliable is Ki-67 immunohistochemistry in grade 2 breast carcinomas? A QA study of the Swiss Working Group of Breast- and Gynecopathologists. PLoS One 2012; 7(5): e37379.

30. Goldhirsch A, Winer EP, Coates AS, et al. Personalizing the treatment of women with early breast cancer: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer. 2013 Ann Oncol 2013; 24(9): 2206-2223.

31. Reis-Filho JS, Simpson PT, Gale T, Lakhani SR. The molecular genetics of breast cancer: the contribution of comparative genomic hybridization. Pathol Res Pract 2005; 201(11): 713-725.

32. Buerger H, Otterbach F, Simon R, et al. Comparative genomic hybridization of ductal carcinoma in situ of the breast-evidence of multiple genetic pathways. J Pathol 1999; 187(4): 396-402.

33. Buerger H, Otterbach F, Simon R, et al. Different genetic pathways in the evolution of invasive breast cancer are associated with distinct morphological subtypes. J Pathol 1999; 189(4): 521-526.

34. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature 2000; 406(6797): 747-752.

35. van ‘t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002; 415(6871): 530-536.

36. van de Vijver MJ, He YD, van’t Veer LJ, et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002; 347(25): 1999-2009.

37. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98(19): 10869-10874.

38. Sotiriou C, Neo SY, McShane LM, et al. Breast cancer classification and prognosis based on gene expression profiles from a population-based study. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100(18): 10393-10398.

39. Badve S, Dabbs DJ, Schnitt SJ, et al. Basal-like and triple-negative breast cancers: a critical review with an emphasis on the implications for pathologists and oncologists. Mod Pathol 2011; 24(2): 157-167.

40. Green AR, Powe DG, Rakha EA, et al. Identification of key clinical phenotypes of breast cancer using a reduced panel of protein biomarkers. Br J Cancer 2013; 109(7): 1886-1894.

41. Boecker W, Buerger H. Evidence of progenitor cells of glandular and myoepithelial cell lineages in the human adult female breast epithelium: a new progenitor (adult stem) cell concept. Cell Prolif 2003; 36 (Suppl 1): 73-84.

42. Boecker W, Buerger H, Schmitz K, et al. Ductal epithelial proliferations of the breast: a biological continuum? Comparative genomic hybridization and high-molecular-weight cytokeratin expression patterns. J Pathol 2001; 195(4): 415-421.

43. Otterbach F, Bankfalvi A, Bergner S, Decker T, Krech R, Boecker W. Cytokeratin 5/6 immunohistochemistry assists the differential diagnosis of atypical proliferations of the breast Histopathology. 2000; 37(3): 232-240.

44. Sorlie T. Molecular portraits of breast cancer: tumour subtypes as distinct disease entities. Eur J Cancer 2004; 40(18): 2667-2675.

45. Sotiriou C, Wirapati P, Loi S, et al. Gene expression profiling in breast cancer: understanding the molecular basis of histologic grade to improve prognosis. J Natl Cancer Inst 2006; 98(4): 262-272.

46. Al Tamimi DM, Shawarby MA, Ahmed A, Hassan AK, AlOdaini AA. Protein expression profile and prevalence pattern of the molecular classes of breast cancer--a Saudi population based study. BMC Cancer 2010; 10: 223.

47. Habashy HO, Powe DG, Abdel-Fatah TM, et al. A review of the biological and clinical characteristics of luminal-like oestrogen receptor-positive breast cancer. Histopathology 2012; 60(6): 854-863.

48. Cheang MC, Chia SK, Voduc D, et al. Ki67 index, HER2 status, and prognosis of patients with luminal B breast cancer. J Natl Cancer Inst 2009; 101(10): 736-750.

49. Prat A, Perou CM. Deconstructing the molecular portraits of breast cancer. Mol Oncol 2011; 5(1): 5-23.

50. Loi S, Sotiriou C, Haibe-Kains B, et al. Gene expression profiling identifies activated growth factor signaling in poor prognosis (Luminal-B) estrogen receptor positive breast cancer. BMC Med Genomics 2009; 2: 37.

51. Bhargava R, Striebel J, Beriwal S, et al. Prevalence, morphologic features and proliferation indices of breast carcinoma molecular classes using immunohistochemical surrogate markers. Int J Clin Exp Pathol 2009; 2(5): 444-455.

52. Bhargava R, Beriwal S, Dabbs DJ, et al. Immunohistochemical surrogate markers of breast cancer molecular classes predicts response to neoadjuvant chemotherapy: a single institutional experience with 359 cases. Cancer 2010; 116(6): 1431-1439.

53. Jacquemier J, Ginestier C, Rougemont J, et al. Protein expression profiling identifies subclasses of breast cancer and predicts prognosis. Cancer Res 2005; 65(3): 767-779.

54. Gazinska P, Grigoriadis A, Brown JP, et al. Comparison of basal-like triple-negative breast cancer defined by morphology, immunohistochemistry and transcriptional profiles. Mod Pathol 2013; 26(7): 955-966.

55. Korsching E, Jeffrey SS, Meinerz W, Decker T, Boecker W, Buerger H. Basal carcinoma of the breast revisited: an old entity with new interpretations. J Clin Pathol 2008; 61(5): 553-560.

56. Grim J, Jandik P, Slanska I, et al. Low expression of NQO1 predicts pathological complete response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients treated with TAC regimen. Folia Biol (Praha) 2012; 58(5): 185-192.

57. Linn SC, Van ‘t Veer LJ. Clinical relevance of the triple-negative breast cancer concept: genetic basis and clinical utility of the concept. Eur J Cancer 2009; 45 Suppl 1: 11-26.

58. Galanina N, Bossuyt V, Harris LN. Molecular predictors of response to therapy for breast cancer. Cancer J 2011; 17(2): 96-103.

59. Dowsett M, Cuzick J, Wale C, et al. Prediction of risk of distant recurrence using the 21-gene recurrence score in node-negative and node-positive postmenopausal patients with breast cancer treated with anastrozole or tamoxifen: a TransATAC study. J Clin Oncol 2010; 28(11): 1829-1834.

60. Mook S, Van’t Veer LJ, Rutgers EJ, Piccart-Gebhart MJ, Cardoso F. Individualization of therapy using Mammaprint: from development to the MINDACT Trial. Cancer Genomics Proteomics 2007; 4(3): 147-155.

61. Bueno-de-Mesquita JM, Linn SC, Keijzer R, et al. Validation of 70-gene prognosis signature in node-negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2009; 117(3): 483-495.

62. Sapino A, Roepman P, Linn SC, et al. MammaPrint molecular diagnostics on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Mol Diagn 2014; 16(2): 190-197.

63. Cusumano PG, Generali D, Ciruelos E, et al. European inter-institutional impact study of MammaPrint. Breast 2014; 23(4): 423-428.

64. Exner R, Bago-Horvath Z, Bartsch R, et al. The multigene signature MammaPrint impacts on multidisciplinary team decisions in ER, HER2 early breast cancer. Br J Cancer 2014;111(5): 837-842.

65. Mamounas EP, Tang G, Fisher B, et al. Association between the 21-gene recurrence score assay and risk of locoregional recurrence in node-negative, estrogen receptor-positive breast cancer: results from NSABP B-14 and NSABP B-20. J Clin Oncol 2010; 28(10): 1677-1683.

66. Lee JJ, Shen J. Is the Oncotype DX assay necessary in strongly estrogen receptor-positive breast cancers? Am Surg 2011; 77(10): 1364-1367.

67. Paik S. Is gene array testing to be considered routine now? Breast 2011; 20 (Suppl 3): S87-91.

68. Brenton JD, Carey LA, Ahmed AA, Caldas C. Molecular classification and molecular forecasting of breast cancer: ready for clinical application? J Clin Oncol 2005; 23(29): 7350-7360.

69. Cornejo KM, Kandil D, Khan A, Cosar EF. Theranostic and molecular classification of breast cancer. Arch Pathol Lab Med 2014; 138(1): 44-56.

70. Dowsett M, Sestak I, Lopez-Knowles E, et al. Comparison of PAM50 risk of recurrence score with oncotype DX and IHC4 for predicting risk of distant recurrence after endocrine therapy. J Clin Oncol 2013; 31(22): 2783-2790.

71. Cuzick J, Dowsett M, Pineda S, et al. Prognostic value of a combined estrogen receptor, progesterone receptor, Ki-67, and human epidermal growth factor receptor 2 immunohistochemical score and comparison with the Genomic Health recurrence score in early breast cancer. J Clin Oncol 2011; 29(32): 4273-4278.

72. Kondo M, Hoshi SL, Ishiguro H, Toi M. Economic evaluation of the 70-gene prognosis-signature (MammaPrint(R)) in hormone receptor-positive, lymph node-negative, human epidermal growth factor receptor type 2-negative early stage breast cancer in Japan. Breast Cancer Res Treat 2012; 133(2): 759-768.

73. Yang M, Rajan S, Issa AM. Cost effectiveness of gene expression profiling for early stage breast cancer: a decision-analytic model. Cancer 2012; 118(20): 5163-5170.

74. Kamal AH, Loprinzi CL, Reynolds C, et al. Breast medical oncologists’ use of standard prognostic factors to predict a 21-gene recurrence score. Oncologist 2011; 16(10): 1359-1366.

75. Buerger H, Mommers EC, Littmann R, et al. Ductal invasive G2 and G3 carcinomas of the breast are the end stages of at least two different lines of genetic evolution. J Pathol 2001; 194(2): 165-170.

76. Hornychova H, Melichar B, Tomsova M, Mergancova J, Urminska H, Ryska A. Tumor-infiltrating lymphocytes predict response to neoadjuvant chemotherapy in patients with breast carcinoma. Cancer Invest 2008; 26(10): 1024-1031.