Corynebacterium durum a možnosti jeho identifikace

Corynebacterium durum je oportunní aktinomyceta, která patří do medicínsky významného podřádu Corynebacterianeae. Ten zahrnuje čeledi Corynebacteriaceae, Mycobacteriaceae a Nocardiaceae. Jedná se o bakterie velmi odolné k environmentálním faktorům řazené do uměle vytvořené skupiny „aerobních aktinomycet v užším slova smyslu“, které často kolonizují dýchací cesty i povrch lidského těla a mohou vyvolat endogenní infekce [10, 21]. Do čeledi Corynebacteriaceae a rodu Corynebacterium patří také mikroaerofilní druhy jako C. durum nebo C. matruchotii, které obývají prostředí sliznic dutiny ústní a dýchacích cest [8, 11, 21]. Tyto druhy se překrývají se skupinou „mikroaerofilních aktinomycet“ (MAFA), s jinou účelově vytvořenou skupinou bakterií s podobnou morfologií, fenotypovými vlastnostmi a diagnostickou strategií jako u výše zmíněných „aerobních aktinomycet“.

Diagnóza infekcí způsobených korynebakteriemi je velmi závislá na možnostech a schopnostech laboratoře tyto mikroorganismy identifikovat [6, 10]. Určení korynebakterií není vždy jednoduchou záležitostí, což platí jak pro rutinní diagnostiku, tak pro sbírkové kmeny (ATCC), protože morfologické i biochemické vlastnosti C. durum jsou velmi podobné ostatním korynebakteriím [1, 10]. Rutinní laboratoře mohou využít k diferenciaci izolátů jejich fenotypové vlastnosti, morfologii kolonií, mikroskopii a základní biochemické testy (tab. 1).

Tabulka 1. Fenotypové vlastnosti odlišující Corynebacterium durum od vybraných aktinomycet [10, 17, 20]
Table 1. Phenotypic characteristics distinguishing Corynebacterium durum from selected actinomycetes [10, 17, 20]

Vysvětlivky: + (pozitivní), – (negativní), V (variabilní) Notes: + (positive), – (negative), V (variable)

Jako první poukázal na patogenní potenciál C. durum v souvislosti s jeho přítomností v klinickém izolátu Riegel et al. (1997) [17], zpětná analýza však odhalila, že už v roce 1971 byl v České republice tento bakteriální druh izolován ze sputa a podrobně popsán Scharfenem (1971). Studovaný kmen byl pod kódovým číslem (RL – 348) součástí sbírky NRL pro patogenní aktinomycety a teprve jeho sekvenace roku 2008 odhalila, že se jednalo o C. durum [21].

První izolované kmeny C. durum pocházely z respiračních vzorků (sputum, bronchoalveolární lavážní tekutina) imunokompromitovaných pacientů s pneumonií, včetně, jak ukázaly novější studie, u pacientů s cystickou fibrózou [9, 18]. Později byly kmeny C. durum vykultivovány také z extrapulmonálních materiálů – abscesů, zánětu dásní a hemokultur [1]. Studium mikrobioty pomocí nových sekvenačních metod, v souladu se staršími nálezy, ukázalo, že C. durum hraje především významnou roli ve zdraví dutiny ústní jako prospěšný komenzální druh, pravděpodobně nepřímo prostřednictvím interakcí s orálními streptokoky, takže jeho patogenní potenciál je v současnosti diskutabilní [11, 14, 15, 16, 23].

Corynebacterium durum je kultivačně poměrně náročné, stejně jako ostatní bakterie ve skupině mikroaerofilních aktinomycet. Roste pomalu na Columbia krevním agaru. Za 48 h při 37 °C tvoří v prostředí obohaceném 5 % CO₂ drobné (0,5–1 mm) kompaktní zvrásněné kolonie, které silně adherují k podkladu (obr. 1). Na chudých agarových půdách (Mueller Hintonův agar) je při epimikroskopii možné pozorovat dobře vyvinuté mycelium, uzavřené kolonie s kompaktním středem a větvením na periferii [22] (obr. 2).

V preparátu barveném dle Grama je možné pozorovat G+ pleomorfní jemné i silnější tyčinky, krátké, některé rohlíčkovitě zahnuté, konce kyjovitě rozšířené. Uspořádání je typické pro korynebakteria do V-forem a palisád. Často se v preparátu vyskytují i krátká vlákna, která se bohatě větví [1, 22] (obr. 3). Při obarvení dle Kinyouna je možné u C. durum na rozdíl od jiných korynebakterií sledovat parciální acidorezistenci (krátké fialovočervené úseky a granulka) [22] (obr. 4).

Běžnými biochemickými testy nelze jednoduše odlišit C. durum od ostatních aktinomycet. Problém u biochemického testu API Coryne (BioMerieux) je příprava homogenního inokula (McFarland 6) z velmi kompaktních drobných kolonií zákal o hustotě odpovídající stupni 6 McFarlandovy stupnice. Test API Coryne by měl být podle manuálu odečten po 24hodinové inkubaci. Vzhledem k pomalému růstu a biochemické aktivitě bakterie je vhodnější po 24 h odečíst jen enzymatické testy a testy fermentace cukrů až za 48 h [1, 17]. Von Graevenitz [11] prodloužil inkubaci dokonce na 4 dny a teprve po této době odečítal výsledek. Potom však nastává komplikace při hodnocení testu, protože C. durum je biochemicky velmi variabilní a odečet výsledku fermentačních reakcí je často subjektivní záležitostí. Výsledkem je množství biotypových skóre, která jsou pro C. durum zaznamenána v jednotlivých studiích [1, 3, 11, 17], ale v databázi API Coryne C. durum chybí, takže je možné provést pouze porovnání výsledku s údaji v literatuře (tab. 2).

Pro kultivaci a současně předběžnou identifikaci C. durum je možné použít i selektivní kultivační médium označené OCM (oral Corynebacterium species medium), na kterém orální korynebakteria dobře rostou a díky utilizaci galaktózy je možné C. durum odlišit od C. matruchotii [24].

Obr. 1. Corynebacterium durum kolonie na krevním agaru Columbia, makrofotografie, skutečná velikost kolonie 1 mm
Foto: MUDr. J. Scharfen, ml.
Figure 1. Corynebacterium durum colonies on Columbia blood agar, macrophoto. Actual colony size 1 mm.
Photo: J. Scharfen, M.D., Jr.

Obr. 2. Epimikroskopie in situ mikrokolonie C. durum na MH agaru v procházejícím světle
Zvětšení 400x při sníženém kondenzoru.
Foto: MUDr. J. Scharfen, ml.
Figure 2. In situ epimicroscopy of C. durum microcolony on MH agar in transmitted light.
Magnification x400 with reduced condenser aperture.
Photo: J. Scharfen, M.D., Jr.

Obr. 3. C. durum nátěr z kultury obarvený dle Grama, typicky kyjovitě rozšířená tyčinka (šipka vlevo dole)
Zvětšení 1000x, foto: J. Scharfen, ml. Figure 3. C. durum smear from Gram-stained culture, typically a club-shaped rod (arrow bottom left)
Magnification x1000. Photo: J. Scharfen, Jr.

Obr. 4. C. durum nátěr z kultury obarvený za studena dle Kyniouna, parciální acidorezistence
Zvětšení 1000x, foto: J. Scharfen, ml.
Figure 4. C. durum smear from Kinyoun cold stained culture, partial acid resistance
Magnification x1000. Photo: J. Scharfen, Jr.

Tabulka 2. Publikovaná biotypová čísla 38 testovaných kmenů C. durum získaná pomocí API Coryne testu
Table 2. Published biotype numbers of 38 tested C. durum strains obtained by the API Coryne test