Vliv typu růstového faktoru na fenotyp subpopulací a kinetiku CD34⁺ buněk v periferní krvi a štěpech periferních kmenových buněk pacientů s non-hodgkinskými lymfomy indikovaných k autologní transplantaci krvetvorby

Overview

Východisko.
Krvetvorné buňky periferní krve jsou preferovaným zdrojem transplantátu při léčbě pacientů s non-hodgkinskými lymfomy. Součástí stimulačního chemoterapeutického režimu je aplikace růstových faktorů. Pro ideální výtěžnost sběru štěpu periferních kmenových buněk je nutný překryv časových oken dosaženého maxima leukocytů a koncentrace CD34⁺ buněk v periferní krvi. Autoři sledovali účinky dvou růstových faktorů (leridistimu a filgrastimu) u pacientů s non-hodgkinskými lymfomy indikovaných k autologní transplantaci na kinetiku a fenotyp CD34⁺ buněk.

Metody a výsledky.
Autoři analyzovali fenotyp subpopulací CD34⁺buněk a kinetiku jejich mobilizace v periferní krvi a v produktech leukaferézy metodou flowcytometrie v průběhu stimulace a sběru transplantátu. Statisticky významné rozdíly byly zjištěny mezi jednotlivými stimulačními faktory v expresi antigenů: CD3, CD5 (T-linie), CD56 (NK-linie), CD20 (B-linie), CD38 (p < 0,05) a CD54 (p < 0,01). Nejvýznamnější rozdíl byl pozorován v zastoupení CD34⁺CD19⁺ subpopulace (B-linie) (p < 0,001).

Závěry.
Exprese jednotlivých antigenů na CD34⁺ subpopulacích se v závislosti na stimulačním faktoru statisticky významně lišila. Kinetika vyplavování CD34⁺ buněk v průběhu stimulace vzhledem k optimalizaci sběru transplantátu nebyla výhodnější pro leridistim oproti filgrastimu.

Klíčová slova:
hematopoetické kmenové buňky, transplantace krvetvorných buněk, růstové faktory, subpopulace CD34⁺ buněk.

Hematopoetické kmenové buňky jsou schopny kompletní regenerace kostní dřeně po myeloablativní chemoterapii a pro klinické účely jsou často ztotožňovány s populací buněk exprimujících antigen CD34. CD34⁺ kompartment však nepředstavuje homogenní populaci: obsahuje hematopoetické pluripotentní kmenové buňky schopné multilineární diferenciace, progenitorové buňky a také prekurzory, které jsou již „lineage-committed“. Buňky fenotypu CD34⁺HLA-DR^- izolované z periferní krve stimulované růstovými faktory jsou schopny indukovat hematopoézu in vitro po dobu 10 týdnů, zatímco u buněk z nestimulované krve je tato doba výrazně kratší (1). Růstové faktory indukují vyplavování frakcí CD34⁺CD38^- buněk do periferní krve (2), obohacených o LTC-IC (long-term culture-initiating cells). Někteří autoři sledovali výskyt jednotlivých subpopulací CD34⁺ buněk v kostní dřeni a pupečníkové krvi i jejich možný význam pro klinické využití (3). Jednotlivé subfrakce CD34⁺ kompartmentu disponují také rozdílnými funkčními charakteristikami (4, 5).

Transplantace periferních kmenových buněk (PBSC – peripheral blood stem cells) se stále více upřednostňuje před kostní dření pro rychlejší přihojení štěpu, zkrácení doby hluboké neutropenie a méně invazivní odběr (6). U některých diagnóz (např. akutní myeloidní leukémie) je použití PBSC transplantátů limitováno rizikem přítomnosti buněk s maligním fenotypem (7). Růstové faktory stimulují vyplavování progenitorových a prekurzorových buněk do periferní krve a umožňují jejich sběr (8). Celkové množství T- a B-lymfocytů se po aplikaci faktoru stimulujícího vyzrávání granulocytů (G-CSF, filgrastim) rovněž zvyšuje, ale nebyla prokázána jeho klinická významnost (9). Naopak aplikace filgrastimu po převodu štěpů bohatých na hemopoetické progenitory pravděpodobně více než proliferaci potencuje jejich maturaci do granulocytární řady, a to zřejmě na úkor megakaryopoézy se zpomalením normalizace trombocytů (10).

Sledování koncentrací CD34⁺ buněk v periferní krvi je spolehlivým ukazatelem pro zahájení separací PBSC. Časné posttransplantační výsledky ukazují přihojení štěpu v průměru za 10 dní s nevelkou spotřebou substituční terapie transfuzními přípravky (11). Koncentrace CD34⁺ buněk se analyzuje standardně v transplantátu i v periferní krvi během mobilizace. Dosud je známo málo o účinku různých růstových faktorů na subpopulace CD34⁺ buněk. Zdá se pravděpodobné, že proporce těchto subpopulací v periferní krvi pacientů budou závislé na použitém růstovém faktoru, resp. na jejich kombinacích (G-CSF, stem cell factor, a jiné (12, 13).

Před časem získal pozornost nový chimerický hematopoetický růstový faktor z myelopoietinové rodiny leridistim, který působí jako agonista obsazující povrchové buněčné receptory pro interleukin-3 (IL-3) a pro faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), působí na buněčnou proliferaci, formování CFUs (colony forming unit) a diferenciaci CD34⁺ buněk (12). Tato bivalentní avidita může vysvětlovat různorodé biologické účinky jako i vliv na hemopoetické buňky v porovnání se samotným G-CSF nebo IL-3. V porovnání s lidským IL-3 (rh-IL-3) disponuje leridistim vyšší afinitou k α-řetězci receptoru pro IL-3, ale jeho vazebná kapacita k heterodimerickému IL-3ß receptoru je nižší než u rhIL-3 (13, 14). Na zvířecích modelech byl prokázán jeho pozitivní vliv na hematopoietickou aktivitu, a to i v kombinaci s jinými cytokiny (15). Studium tohoto geneticky upraveného růstového faktoru dalo příležitost srovnat jeho účinek na stimulaci hematopoetických kmenových buněk s účinkem G CSF (filgrastim), jenž je používán standardně v protokolech sběru štěpu. Znalost kinetiky subpopulací CD34⁺ kompartmentu se může stát přínosem pro predikci engraftmentu, překlenutí trombocytopenie a granulocytopenie či prevenci reakce štěpu proti hostiteli (GvHD – graft-versus-host disease) u transplantovaných (16, 17). Autoři předkládají výsledky analýzy CD34⁺ buněk a CD34⁺ subpopulací z periferní krve a PBSC pacientů, kteří podstoupili stimulační chemoterapeutický režim buď s G-CSF, nebo leridistimem.

SOUBOR PACIENTŮ A POUŽITÉ METODY

Pacienti

Do klinické studie srovnání preparátů leridistim (Searle, USA) a filgrastim (r-metHuG-CSF, Amgen, Inc., USA) bylo zařazeno 19 pacientů, 7 žen a 12 mužů (pro bližší charakteristiku souboru viz tab. 1). Dle protokolu popsaného níže podstoupili pacienti úspěšnou analýzu fenotypizace subpopulací CD34. Pacienti byli léčeni kombinací cyklofosfamidu a etoposidu (režim E-Cykl, Etoposid 200 mg/m² den 1–3, Cyklofosfamid 4 g/m² den 1) s následnou aplikací jednoho z růstových faktorů. Všechny krevní vzorky a vzorky PBSC byly odebrány v souladu s informovaným souhlasem pacienta.

Sběr a analýzy vzorků

Analýzy byly prováděny následovně: 1. den stimulační chemoterapie – stanovení CD34⁺ buněk v periferní krvi (negativní kontrola), 10. den (nebo počet leukocytů (wbc) 1, pokud dříve) až 15. den (nebo poslední separace kmenových buněk periferní krve, pokud později) – denně stanovení CD34⁺ buněk v periferní krvi. Pokud dosáhly hodnoty wbc 1 a CD34⁺ 0,1 % (absolutní počet CD34⁺ 5×10⁶/1), byla provedena fenotypizace subpopulací CD34⁺ buněk v periferní krvi. V den separace kmenových buněk periferní krve byly stanoveny CD34⁺ buňky a provedena fenotypizace subpopulací CD34⁺ buněk v produktu leukaferézy.

Flowcytometrická analýza subpopulací CD34⁺

Vzorky periferní krve nebo leukaferézy byly inkubovány po dobu 30 minut s přímo označenými monoklonálními protilátkami v saturující koncentraci při 4°C. Po inkubaci byly lyzovány erytrocyty ve vzorku a vzorek analyzován po fixaci. Analýza se prováděla na flow cytometru Epics XL (Beckman-Coulter, USA) vybaveném argonovým laserem, třemi fotonásobiči pro analýzu fluorescence a softwarem XL2. Byly použity přímo označené monoklonální protilátky (Caltag, Becton-Dickinson, Immunotech, USA) a provedeny příslušné negativní kontroly. K analýze subpopulací CD34⁺ byla použita směs protilátek označených fluorescein isothiocyanátem (FITC), R-phycoerythrinem (PE) a peridinin chlorophyl proteinem (PerCP). Relativní exprese antigenů byla stanovena na populaci CD34⁺ ve speciálně navrženém tříbarevném multigatingovém protokolu. Na populacích CD34⁺ buněk byly analyzovány antigeny CD2, CD3, CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD33, CD38, CD45, CD54, CD56, CD71, CD90 a HLA-DR. Výsledky byly vyjádřeny jako relativní hodnoty – % CD34⁺ buněk ze všech leukocytů a % jiných antigenů exprimovaných na CD34⁺ buňkách ze všech CD34⁺ buněk. Zastoupení CD34⁺ bylo kalkulováno jako vážený průměr vzhledem ke dni měření společně se směrodatnou odchylkou. Absolutní hodnoty CD34⁺ buněk byly kalkulovány z relativních hodnot a koncentrací leukocytů (wbc).

Statistická analýza

Pro sledování případného rozdílu mezi skupinami s leridistimem a filgrastimem byl pro každou zkoumanou koncetraci některé ze subpopulací CD34⁺ buněk použit smíšený lineární model:

Y_ij(t)=A_i + B_i + a_i + c_it + d_it² + ε_ij,

kde Y_ij(t) je j-té pozorování zkoumané veličiny, tj. koncentrace některé ze subpopulací CD34⁺ buněk, v i-té skupině ve dni t. Index probíhá uvažované skupiny s různými růstovými faktory (i = 0 pro leridistim, resp. i = 1 pro filgrastim), a_i, b_i, a c_i jsou regresní koeficienty pro polynom druhého stupně uvnitř dané skupiny pacientů, A_i je regresní koeficient v modelu třídění skupin (leridistim, resp. filgrastim), B_i je regresní koeficient v modelu třídění skupin (periferní krev, resp. PBSC). Volba polynomu vycházela z předpokladu, že zkoumaná veličina bude v průběhu času měnit svou hodnotu nejprve směrem dolů a pak opět poroste. Je to přirozená aproximace uvažovaného průběhu chování zkoumané veličiny v čase. V tomto modelu může být toto chování odlišné pro obě skupiny pacientů, např. doba minima křivky. Symboly ε_ij jsou označeny nezávislé náhodné veličiny se shodným rozdělením N(0,σ²). Ve výše uvedeném modelu byla provedena analýza rozptylu mezi skupinami leridistimu a filgrastimu.

Výsledky

Výsledky pro každou analýzu jsou sumarizovány v tabulkách a vyjádřeny rovněž ve formě grafů pro periferní krev a pro štěpy kmenových buněk periferní krve. Průměrné hodnoty a směrodatné odchylky se používaly jako charakteristiky údajů a byla stanovena kinetika kmenových buněk CD34⁺ v periferní krvi a štěpu PBSC, jakož i průměrné zastoupení jejich subpopulací. Pacienti byli rozděleni do dvou skupin (leridistim a G-CSF) podle aplikovaného růstového faktoru.

Všichni pacienti byli transplantováni. Pacientům stimulovaným leridistimem bylo podáno 15,0×10⁶Ī7,0×10⁶ CD34⁺ buněk. Pacientům stimulovaným G-CSF bylo podáno 16,0×10⁶ Ī 13,4×10⁶ CD34⁺ buněk.

Analýza CD34⁺ buněk

Absolutní hodnoty CD34⁺ buněk, kalkulovány z průměru relativních hodnot zjištěných pomocí flow cytometrie a hodnot wbc, jsou uvedeny v tabulce 2. Jako negativní kontrola byly analyzovány vzorky krve v den 1 před zahájením chemoterapie. Medián koncentrace CD34⁺ buněk v den 1 byl roven nule, průměr Ī s.d. relativní 0,03 Ī 0,02 % a absolutní 0,0015 Ī 0,0010 × 10⁹/l. Relativní a absolutní počty CD34⁺ buněk jsou analyzovány v periferní krvi nezávisle pro skupiny stimulované leridistimem a G-CSF. Kinetika vyplavování CD34⁺ buněk v krvi je porovnána s nárůstem leukocytů po stimulaci (obr. 1).

Analýza subpopulací CD34⁺ buněk

Relativní exprese 12 antigenů na populaci CD34⁺ buněk je analyzována v periferní krvi a štěpech kmenových buněk periferní krve po stimulačním režimu, zvlášť pro skupinu pacientů léčených leridistimem a pro skupinu pacientů léčených G-CSF (obr. 2, 3).

Statistická analýza

V tabulce 3 jsou zachyceny hladiny významnosti pro zamítnutí nulové hypotézy ve výše popsaném modelu (tj. H nebyl určen rozdíl hodnot mezi oběma růstovými faktory). Výsledky uvádíme pouze pro ty subpopulace, kde se vyskytl významný rozdíl mezi hodnotami. Označení hvězdičkami odpovídá dosažené hladině významnosti.

Výzkum a analýza CD34⁺ buněk v periferní krvi a štěpech kmenových buněk periferní krve odhalily významné rozdíly mezi farmakologickými účinky leridistimu a filgrastimu v rámci stimulační chemoterapie. Z uvedených údajů autoři shrnují následující závěry:

Změny v leukocytech periferní krve a CD34⁺ buňkách po stimulaci růstovým faktorem G-CSF ukazují překryv s oknem ideální kolekce kmenových buněk periferní krve 14. a 15. den stimulační chemoterapie (obr. 1). Po stimulaci leridistimem se v krvi objeví CD34⁺ buňky ve vysoké relativní koncentraci, která ale klesá v době, kdy počet leukocytů narůstá. Tudíž relativní maxima CD34⁺ buněk a leukocytů periferní krve se v případě leridistimu míjejí, a to snižuje absolutní koncentraci CD34⁺ buněk v krvi (tab. 2).

Analýza antigenů na CD34⁺ buňkách po stimulaci oběma faktory ukazuje téměř 100% expresi antigenu CD45, vysokou úroveň exprese CD38 a CD71 a střední úroveň exprese HLA-DR. Fenotyp subpopulací CD34⁺ buněk v PBSC přitom reflektuje jejich relativní zastoupení v periferní krvi. CD34⁺ buňky stimulované leridistimem mají významně nižší expresi antigenů specifických pro jednotlivé linie. Byl zjištěn rozdíl v expresi antigenů B, T, NK i myeloidní linie. Nejvýznamnější rozdíly byly pozorovány v expresi antigenu CD19 linie B na populaci CD34⁺ buněk. Významné rozdíly byly také pozorovány v expresích antigenů linie T (CD3, CD5), antigenu linie NK (CD56), dalšího antigenu linie B (CD20), a v linii nespecifických antigenů (CD38, CD54) (tab. 3).

Diskuze

Většina CD34⁺ buněk jsou buňky více či méně předurčené k diferenciaci do jedné z linií. Tyto buňky by mohly být identifikovány jako buňky exprimující jeden nebo více antigenů specifických pro určitou linii, přičemž jsou zodpovědné za rychlou fázi přihojení štěpu. Na druhé straně jsou pluripotentní kmenové buňky zodpovědné za dlouhodobé přihojení a jsou také schopny se diferencovat do všech linií krevních buněk, ale plná obnova funkce kostní dřeně je pomalejší. Podávání růstových faktorů v procesu mobilizace před plánovanou transplantací hematopoetických buněk vede ke změnám v relativním i absolutním zastoupení většiny krevních elementů. Hassan et al. uvádí, že obnovení hematopoézy u příjemců alogenního štěpu PBSC může být způsobeno početnějším zastoupením myeloidních progenitorů CD34⁺CD33⁺ a CD34⁺HLA–DR^– v transplantátu (18). Mayer et al. prokázal, že u autologních štěpů není počet mononukleárních buněk vhodným nástrojem na predikci engraftmentu štěpu, zatímco nejvýznamnějším parametrem je dostatečný počet CD34⁺ buněk a CFU-GM (colony forming unit granulocyte macrophage) (19).

V současné době je pro potřeby transplantace hematopoetických kmenových buněk (HSC, hematopoetic stem cells) standardně využíván jen preparát filgrastim (rekombinantní lidský G-CSF, r-metHu G-CSF), který potencuje nástup leukocytózy a přechodnou trombocytopenii během samotného sběru HSCs a jeho nežádoucí účinky jsou malé. Leridistim (myelopoietin) je stejně jako G-CSF schopen uvolňovat vysoké frakce CD34⁺ buněk v periferní cirkulaci, když je podáván jako součást stimulačního chemoterapeutického režimu. Průměrný relativní počet CD34⁺ buněk překračuje 6 % leukocytů, ve srovnání s pouze 1 % u G-CSF. I přes tuto jeho zjevně výhodnou vlastnost se jeho aplikace neprojevila jako optimální – vrcholu počtu CD34⁺ buněk v periferní krvi bylo totiž dosaženo dříve než vrcholu počtu leukocytů, čímž se promeškalo ideální časové okno pro sběr kmenových buněk periferní krve a celkový výnos CD34⁺ buněk byl nižší. Klabusay et al. sledoval efekt mobilizace hematopoetických kmenových buněk pomocí G-CSF v krvi a transplantátech PBSC u zdravých dárců PBSC i vliv leukaferézy na populace leukocytů a na kinetiku hematopoetických kmenových buněk. Absolutní koncentrace CD34⁺ buněk v periferní krvi dárců PBSCs vzrostla od začátku stimulace G-CSF do dne 4 v průměru 26×, přičemž počet CD34⁺ buněk v periferní krvi narůstal během mobilizace až po den 5 relativně i absolutně. V absolutních hodnotách dochází do dne 4 k současnému vzestupu T, B i NK lymfocytů (17). Okno optimálního sběru CD34⁺ buněk se shoduje i s výsledky jiných autorů (např. 20).

V porovnání s CD34⁺ buňkami, které byly stimulovány G-CSF, CD34⁺ buňky stimulované leridistimem exprimovaly antigeny specifické pro linii u menšího počtu buněk. Tento jev pravděpodobně koreluje se stupněm diferenciace CD34⁺ buněk, a tudíž vyšší procento progenitorů specifických pro linii mezi CD34⁺ buňkami stimulovanými G-CSF. Velká část buněk stimulovaných G-CSF exprimuje antigen CD71 (pravděpodobně tvoří progenitory erytropoetické linie) a asi 20 % buněk exprimuje antigeny CD19 (progenitory B-linie). Zbytek těchto buněk jsou progenitory zadané v myeloidních, T a NK liniích. Hematopoetické pluripotentní kmenové buňky tvoří jen malou část CD34⁺ buněk objevující se v periferní krvi v relativně stabilních proporcích po stimulaci. Z kompartmentu CD34⁺ buněk stimulovaných leridistimem méně buněk exprimuje antigen CD71 a jen 5% antigen CD19. Nižší expresi lze pozorovat také u antigenů CD3, CD5, CD7, CD20 a CD56. Tyto výsledky naznačují, že v kompartmentu CD34⁺ buněk existují méně diferencované progenitorové buňky. Nejvýznamnější rozdíly jsou u antigenu CD19 linie B v porovnání s CD34⁺ buňkami stimulovanými G-CSF. Exprese povrchového leukocytárního antigenu CD45 je vysoká při obou typech stimulačního režimu. CD34⁺ buňky stimulované leridistimem mají v porovnání s buňkami stimulovanými G-CSF významně nižší expresi antigenů specifických pro linii. Nabholtz et al. prokázal, že G-CSF je v porovnání s leridistimem také významějším profylaktickým faktorem při prevenci febrilní neutropenie u pacientů s pokročilým nádorem prsu (21). Vyšší proporce méně diferencovaných CD34⁺ buněk v transplantátu může teoreticky vést k prodloužení doby zotavení kostní dřeně a k vyššímu výskytu komplikací po chemoterapii.

Zkratky

CFU – colony forming unit

CFU-Blast – colony forming unit – blast

CFU-GM – colony forming unit granulocyte-macrophage

FITC – fluorescein isothiokyanát

G-CSF – granulocyte-colony stimulating factor

GvHD – graft versus host disease, reakce štěpu proti hostiteli

HSC – hematopoetic stem cell, hematopoetická kmenová buňka

IL-3 – interleukin-3

LTC-IC – long-term culture-initiating cells

PBSC – peripheral blood stem cells, periferní kmenové buňky

PE – R-phycoerythrin

PerCP – peridinin chlorophyl protein

rh-IL-3 – lidský IL-3

wbc – white blood cells, leukocyty

doc. MUDr. Martin Klabusay, Ph.D.

Interní hematoonkologická klinika FN

Jihlavská 20, 625 00 Brno

fax: +420 532 233 603, e-mail: mklabus@fnbrno.cz