Přihlášení

Přihlášený uživatel: . Nejste to Vy? Přihlašte se pod svým e-mailem.

Zadejte prosím své heslo do proLékaře.cz, abychom ověřili, že jste to opravdu Vy.

 
Hemofilie: Novinky
Odborné společnosti
Standardy péče
Kongresy
Zajímavé odkazy
Klasifikace hemofilie
Další...
 

Využití sekvenování nové generace v diagnostice hemofilie

Specializace: hematologie
Téma: Hemofilie

Vydáno: 20.11.2017

Využití sekvenování nové generace v diagnostice hemofilie

Studie španělských autorů přináší molekulárnědiagnostický algoritmus pro hemofilii A a B založený na sekvenování kompletních genů pro koagulační faktory VIII a IX (FVIII a FIX) a von Willebrandův faktor (VWF).

Molekulární techniky v diagnostice hemofilie

Molekulární diagnostika hemofilie A a B (HA a HB) dnes umožňuje např. testování žen příbuzných hemofiliků na přenašečství onemocnění, prenatální a preimplantační diagnostiku i detekci zvýšeného rizika vzniku inhibitoru u pacientů s některými typy mutací. Molekulární testování v diagnostice hemofilie A také pomáhá odlišit toto onemocnění od von Willebrandovy choroby (VWD).

Hemofilie A je způsobena mutacemi v genu pro FVIII (gen F8), který se nachází na q raménku chromozomu X (oblast Xq28), a dosud bylo objeveno přibližně 2 tisíce mutací v kódujících a netranslatovaných oblastech F8. Molekulární diagnostika HA obvykle začíná testováním na přítomnost inverze intronu 22, která je u HA nejčastější mutací (vyskytuje se u cca 30 % všech pacientů a přibližně 50 % těžkých případů), a inverze intronu 1, jež se vyskytuje u přibližně 1 % případů. Tento screening se provádí pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), a pokud je negativní, obvykle bývá následován přímým sekvenováním kódující oblasti genu F8.

Hemofilii B způsobují mutace v genu pro FIX (gen F9), nacházejícím se v oblasti Xq27. 80 % pacientů s HB má bodové mutace (missense/nonsense) a dosud je známo přibližně tisíc různých mutací v genu F9. Sekvenování DNA je zlatým standardem i v diagnostice HB.

Možnosti sekvenování nové generace

Přímá detekce mutací v DNA se obvykle provádí pomocí PCR amplifikace následované Sangerovým sekvenováním, což je pracný přístup, který v 10 % případů stejně nevede k úspěchu (zejména u lehčích případů HA). Sekvenování nové generace (NGS − next generation sequencing) naproti tomu umožňuje souběžné zkoumání několika kompletních genů, jež se mohou nacházet ve zcela odlišných oblastech genomu.

NGS již bylo použito pro sekvenování genů F8 a F9 a momentálně se zavádí do rutinní diagnostiky hemofilie. Cílem studie publikované v časopisu Thrombosis and Haemostasis bylo zhodnotit přínos molekulárnědiagnostického algoritmu, který využívá NGS pro sekvenování genů F8, F9 a VWF v celé jejich délce.

Navržený diagnostický algoritmus

Pacienti s těžkou HA jsou nejprve otestováni na přítomnost inverze intronu 22, a pokud není inverze detekována, pokračuje se testováním intronu 1. Tento přístup by měl identifikovat mutaci způsobující onemocnění přibližně u 45−50 % pacientů s těžkou HA.

U pacientů s negativním výsledkem a dále u nemocných se středně těžkou nebo mírnou HA nebo s jakkoliv závažnou HB se provede NGS celých genů F8, F9 a VWF (celkově se sekvenuje přibližně 395 kb). Pokud není detekována patogenní varianta genu, provede se dále analýza MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) genu F8 pro detekci velkých delecí a duplikací.

Výsledky

Algoritmus byl studován na vzorcích krve od celkem 102 pacientů (78 pacientů s HA, 19 s HB, 3 ženy přenašečky a 2 ženy s příznaky deficience FVIII). Závažnost onemocnění jednotlivých pacientů byla stanovena na základě obvyklých klinických doporučení.

Screening inverze intronu 22 určil diagnózu u 11 z 20 pacientů s těžkou HA a u 1 přenašečky, analýza intronu 1 neodhalila žádné další varianty. NGS poskytlo pozitivní výsledky u 88 případů, z čehož v 8 případech umožnilo rozlišit mírnou/středně těžkou HA od VWD. MLPA u zbývajících 2 pacientů v jednom případě potvrdila velkou exonovou deleci, pouze u jednoho pacienta nebyla nalezena žádná patogenní varianta.

Závěr

Navržený molekulárnědiagnostický algoritmus umožnil identifikaci genetické varianty u 99 % testovaných pacientů s nízkou hladinou FVIII nebo FIX. Simultánní analýza genů F8 a VWF v celé jejich délce správně zařadila pacienty s VWD, kteří byli považováni za přenašeče, nebo pacienty s HA. Navržený algoritmus by tedy byl použitelný pro diagnostiku všech pacientů s hemofilií v rutinní klinické praxi.

(este)

Zdroj: Bastida J. M., González-Porras J. R., Jiménez C. et al. Application of a molecular diagnostic algorithm for haemophilia A and B using next-generation sequencing of entire F8, F9 and VWF genes. Thromb Haemost 2017; 117: 66–74, doi: 10.1160/TH16-05-0375.

 

Hodnocení článku

Ohodnoťte článek:     3,8/5, hodnoceno 4x
 
 

Sdílení a tisk

Doporučit článek e-mailem

Vytisknout
 
 

Čtěte dále

Chirurgické výkony u hemofilie komplikované vývojem inhibitoru

Přípravek FEIBA (antiinhibiční komplex koagulačních faktorů – factor eight inhibitor bypassing activity) vede k dosažení efektivní hemostázy u osob s hemofilií komplikovanou přítomností inhibitoru. Potřebné jsou informace o použití tohoto přípravku v případě chirurgických výkonů. Přinášíme souhrn několika studií zaměřených na hodnocení perioperační účinnosti a bezpečnosti přípravku FEIBA a britských konsenzuálních doporučení k jeho použití při elektivních chirurgických výkonech.

Šestý globální hemofilický summit, Praha 2015 (část 2)

Šestý globální hemofilický summit se uskutečnil v Praze v září 2015. V následující, druhé části souhrnu prezentujeme některá z dalších diskutovaných témat.

Prognostické faktory pro dosažení remise a přežití u pacientů se získanou hemofilií A

Získaná hemofilie A (AHA) je způsobena tvorbou neutralizačních autoprotilátek (inhibitorů) proti faktoru VIII (FVIII). Imunosupresivní léčba (IST) vede v 60–80 % případů k navození remise, je však spojena s častými nežádoucími účinky, mezi něž patří infekce jako hlavní příčina smrti. Definováním ukazatelů, které by umožnily předpovědět čas potřebný k dosažení remise a přizpůsobit intenzitu IST, se zabývala německo-rakouská studie.



Všechny novinky