Technologie mikropolí v diagnostice potravinové alergie pomocí alergenových složek

Souhrn

Účel přehledu:
Metodika velkokapacitních mikropolí (microarray), která obsahují různé alergenové složky fixované na pevné podložce, umožňuje stanovení specifických IgE proti těmto alergenům a přesnější diagnostiku potravinové alergie. V tomto přehledovém článku rozebíráme výsledky, jichž bylo dosud technikou mikropolí dosaženo v diagnostice potravinové alergie.

Nové poznatky:
Technologie mikropolí obsahujících proteiny nebo glykoproteiny nám umožňuje zjistit profil senzibilizace pacientů s potravinovou alergií. V současné době jsou komerčně dostupné metody, jež nám umožňují stanovit specifické IgE proti 103 alergenním molekulám. V celosvětovém měřítku byla v některých laboratořích tato technika zkoumána a optimalizována pro několik alergenových extraktů a výsledky byly slibné – metodika měla vysokou specificitu a senzitivitu, výsledky navíc dobře korelovaly s již existujícími konvenčními testy.

Souhrn:
V posledních letech se díky pokroku v molekulární biologii a ve vývoji nových technologií pro výrobu velkokapacitních matric s pevnou fází, jakou je například technologie mikropolí, zlepšila diagnostika potravinové alergie. V současnosti je možné analyzovat přecitlivělost na různé zdroje alergenů zprostředkovanou specifickými IgE stanovením specifických IgE proti alergenním proteinům či glykoproteinům. Tato změna nevedla jen ke zpřesnění diagnostiky senzibilizace, ale umožnila nám také vysvětlit různá rizika senzibilizace na určité molekuly, v mnoha případech fenomén zkřížené reaktivity, a dokonce může korigovat námi poskytovaná klinická doporučení. Pro přesnější vyhodnocení možností této nové techniky však bude třeba uskutečnit další studie.

Klíčová slova:
molekulární diagnostika, peptidy, potravinová alergie, specifické IgE, technologie mikropolí

Úvod

V posledních desetiletích jsme byli svědky identifikace, izolace a purifikace velkého počtu různých alergenů na jedné straně a využití technologie rekombinantní DNA na poli alergologie na straně druhé. Biotechnologická výroba alergenů s vysokou čistotou a stálou kvalitou, a to jak přirozených, tak rekombinantních, představuje skutečný pokrok v klinické alergologii [1].

Kombinace úspěchů na poli molekulární biologie a nanotechnologie umožnila vývoj nových nástrojů, jako je metodika mikropolí (microarray). Technologie proteinových mikropolí umožňuje odhalit v jednom vyšetření specifické IgE proti mnoha molekulám, tedy provádět tzv. molekulární diagnostiku neboli diagnostiku pomocí alergenových složek (component-resolved diagnosis, CRD). To má přirozeně velký význam i pro diagnostiku potravinové alergie [2].

Zmínka o prvním pokusném mikropoli systému pochází z roku 2000 [3]. Původně se pomocí této metodiky vyšetřovala přecitlivělost na omezený počet alergenů získaných z jednoho zdroje alergenů [3–5] nebo na proteiny extrahované z 35 různých zdrojů alergenů [6,7].

Později byly vytvořeny systémy mikropolí s čím dál větším počtem rekombinantních nebo purifikovaných molekul. Prototyp ISAC vyrobený společností Phadia byl první metodou proteinových mikropolí použitou pro stanovení specifických IgE a ve své aktuální verzi (z ledna 2011) obsahuje 103 alergenů (ImmunoCAP ISAC-CRD 103^®, Phadia, Uppsala, Švédsko).

Tato metodika se zrodila uprostřed velkých očekávání, neboť teoreticky by bylo možné mikroanalýzu použít pro diagnostiku alergie [8], což by klinickým lékařům přineslo podrobné informace o profilu senzibilizace pacientů. Díky tomu by bylo možné předvídat v některých případech závažnost a další vývoj reakcí a také získat přesné indikace pro imunoterapii u inhalační alergie, popřípadě další indikace.

Molekulární diagnostika neboli diagnostika pomocí alergenových složek

Pojem „diagnostika pomocí alergenových složek“ (CRD) [1] otevřel novou epochu diagnostiky a imunopatologických koncepcí alergie.

Užití vhodného panelu purifikovaných alergenů, ať již přirozených, nebo rekombinantních, umožnilo vylepšit tradiční diagnostické techniky stanovení specifických IgE, v nichž se používají celé alergenové extrakty. Zvýšila se senzitivita a reprodukovatelnost testu a také stabilita alergenů, zvláště v případě potravin rostlinného původu, které mají nízký obsah proteinů a jejichž enzymatická aktivita může znehodnocovat alergeny [9,10].

Metoda CRD nám umožňuje odhalit individuální obraz senzibilizace na různé proteiny ze stejného zdroje alergenů s možností zjistit také následující:

• a) obraz senzibilizace v určitých zeměpisných oblastech [11,12];
• b) senzibilizaci na proteiny spojené s vyšším rizikem těžkých reakcí, například lipid-transfer proteiny (LTP) [12,13];
• c) senzibilizaci na homologní proteiny různých potravin, jež může být někdy příčinou fenoménu zkřížené reaktivity mezi jinak fyzicky nepříbuznými druhy ovoce [14–16].

Významné antigeny a zkřížená reaktivita

Přítomnost specifických IgE proti určitým zdrojům alergenů nebývá vždy spojena s klinickými příznaky a tedy ani s klinicky relevantní potravinovou alergií. Jednou z častých příčin této falešné pozitivity je zkřížená reaktivita mezi homologními alergenovými složkami různých zdrojů alergenů, z nichž některé nejsou taxonomicky příbuzné.

Zkřížená reaktivita mezi podobnými molekulárními strukturami obsaženými v potravinách nebo inhalačních alergenech bývá odpovědná za klinické projevy nebo syndromy, jako jsou například syndrom latex–ovoce, jehož molekulárním podkladem je chitináza (Hev b 2), a rovněž panalergeny, jako jsou profiliny (Hev b 8) nebo patatiny (Hev b 7), zkřížená reaktivita mezi čeledí růžovité (Rosaceae) a pylem břízy a trav, obvykle způsobená PR-10 a profiliny, syndrom prachový roztoč–kreveta–šváb, jehož podkladem bývá tropomyozin, syndrom kuře–vejce, způsobený livetiny, syndrom prase–kočka a další typy zkřížené reaktivity mezi masem a epiteliemi s účastí sérového albuminu. Navíc senzibilizace na potravinové alergeny z fylogeneticky dobře konzervovaných rodin, jako jsou zásobní proteiny (2S-albuminy, viciliny a leguminy) a LTP, bývá příčinou imunologicky zkřížené reaktivity mezi potravinami (v případě zásobních proteinů ořechy, luštěniny a/nebo semena; v případě LTP čeleď růžovité, ostatní druhy ovoce, zelenina a potraviny rostlinného původu obecně) s proměnlivou klinickou odezvou. V každém případě nám znalost individuálního profilu senzibilizace pacienta umožňuje analyzovat možné syndromy zkřížené reaktivity [1], dále testovat, co nemocný toleruje, a poskytnout mu příslušná preventivní doporučení.

Riziko těžkých reakcí u potravinové alergie

Existují významné důkazy o tom, že kombinace určitých klinických projevů a senzibilizace na různé alergenové složky ze stejného zdroje [12,17] může být spojena s různou intenzitou alergické odpovědi. Dobrým příkladem může být odlišný obraz senzibilizace na alergenové složky pšenice [18] u pacientů s tzv. pekařským astmatem, potravinovou alergií na pšeničnou mouku, alergií na pyl pšenice a s anafylaxí navozenou námahou po požití obilovin. Kromě toho senzibilizace na nestabilní molekuly, jako jsou proteiny rodiny PR-10 nebo profiliny, bývá spojena s místními příznaky po požití syrové zeleniny, kdežto senzibilizace na alergeny odolnější vůči fyzikálním a chemickým vlivům, jako jsou LTP, chitinázy, viciliny, 2S-albuminy, leguminy a 5-ω-gliadin, vede spíše k systémovým reakcím, a to dokonce i po požití zpracovaných potravin.

Epitopy spojené s perzistencí potravinové alergie

Dalším krokem v diagnostice je určení epitopů alergenních molekul, proti nimž se vyvinula senzibilizace na různé alergenové složky ze stejného zdroje [19]. Lin a Sampson [20] zkoumali pomocí technologie mikropolí možné použití sekvenčních epitopů vázajících IgE coby biomarkerů různých fenotypů potravinové alergie. Použitou technologii mikropolí považovali za robustní metodiku použitelnou k mapování potravinových alergenů a naznačili, že může být dokonce citlivější než technologie využívající membrány SPOTS [19].

Séra pacientů s perzistující potravinovou alergií na vejce rozpoznávají sekvenční epitopy a obsahují vyšší koncentrace specifických IgE než séra pacientů s dosaženou tolerancí této potraviny [21].

U alergie na mléko se potvrdilo, že IgE proti určitým alergenovým epitopům proteinů kravského mléka je možné použít jako markery perzistence alergie. Spojení těchto peptidů ve vyšetřovací matrici by mělo umožnit provedení velkých prospektivních studií a v budoucnosti tyto diagnostické postupy zjednodušit [22].

U kojenců s alergií na kravské mléko byl pozorován časný ústup obtíží spojený s poklesem IgE a se vzestupem IgG4 vázajících se na epitopy kravského mléka [23]. Pacienti s alergií na mléko rozpoznávají širší spektrum epitopů vázajících IgE v porovnání s těmi, kteří již svou alergii překonali a jsou v tomto ohledu podobni pacientům, kteří mléko tolerují. Vazba většího počtu peptidů na IgE bývá spojena s těžšími reakcemi při provokačním testu [24].

Studie ověřující využití technologie mikropolí pomocí vlastnoručně připravených nebo komerčně dostupných metod (ISAC) v diagnostice potravinové alergie

Při porovnání vyšetření pomocí technologie mikropolí s konvenčními testy detekce specifických IgE s pevnou fází bývá patrná dobrá korelace výsledků [4,7,25–28], přestože u některých alergenů může být senzitivita metodiky mikropolí nižší [28] v důsledku nedostatečné glykosylace proteinů v bakteriálních systémech používaných k jejich produkci, což může hrát důležitou úlohu ve vazbě na IgE [29], nebo z toho důvodu, že panel možných alergenových složek nebyl úplný. Ott a spol. [30^••] vyšetřili 130 dětí s podezřením na potravinovou alergii zprostředkovanou IgE s použitím provokačního testu s kravským mlékem a/nebo vejci, dále kožních testů a vyšetření specifických IgE. Použili metodu mikropolí (ISAC CRD-51^®, VBC Genomics Bioscience Research, Vídeň, Rakousko) obsahující ovomukoid, ovalbumin, lysozym, α-laktalbumin, β-laktoglobulin a kaseiny. Pozitivní prediktivní hodnota použité metody byla 77 % pro mléko a 100 % pro vejce, přičemž všechny složky se testovaly v jedné sadě. Podle autorů vyšetření senzibilizace na jednotlivé složky mléka a vajec zprostředkované IgE s použitím této metody mikropolí přineslo výsledky obdobné vyšetření kožními testy a/nebo specifických IgE. Nebyla nalezena žádná jednotlivá složka, jež by pomohla odlišit podstatnou senzibilizaci od nepodstatné.

Kromě toho Gaudin a spol. [27] zkoumali pomocí metodiky mikropolí senzibilizaci na proteiny nejčastěji odpovědné za senzibilizaci dětí na mléko; nalezli různé profily senzibilizace u dětí s klinickou manifestací alergie i bez ní a zjistili, že hlavním antigenem u alergie na kravské mléko je bovinní laktoferrin.

Podle zveřejněných údajů je u dětí s podezřením na alergii na mléko a/nebo vejce možné pomocí metody ISAC CRD-89^® (Phadia) předpovědět pozitivní výsledek provokačního testu a v případech, kdy je výsledek testu ImmunoCAP nižší než 95 % klinicky rozhodného bodu, je možné ho použít jako metodu druhé volby a tím omezit nutnost provedení provokačního testu [31].

Děti s alergií na krevetu měly vyšší koncentrace specifických IgE proti krevetě a silněji se u nich vázaly peptidy krevety, konkrétně tropomyozin, argininkináza, lehký řetězec myozinu a sarkoplazmový protein vázající kalcium. Děti také vykazovaly větší diverzitu epitopů než dospělí [32], což naznačuje, že senzibilizace na krevetu klesá s věkem.

Constantin a spol. [18] rovněž vyvinuli metodu mikropolí obsahujících alergenní molekuly a podle nich bude možné vyvinout sérologický test využívající mikropole s rekombinantními alergeny pšeničného zrna a pylu trav, který bude sloužit k rozlišení astmatu pekařů, potravinové alergie vyvolané pšenicí a alergie na pyl trav.

U pacientů s anafylaxí navozenou námahou byly identifikovány různé epitopy [33]. Battais a spol. [34] odhalili určité epitopy vázající IgE na gliadinech, které souvisely s přítomností alergie na pšeničnou mouku.

Různé studie provedené u pacientů s alergií na arašídy [35,36] prokázaly pomocí technologie mikropolí, že senzibilizace na určité alergenní proteiny arašídů může mít vztah k závažnosti klinických příznaků. Pacienti s anamnézou závažnějších multisystémových reakcí rozpoznávali větší počet epitopů Ara h 1, Ara h 2 a Ara h 3 a navíc byla zjištěna korelace mezi spektrem epitopů Ara h 1, Ara h 2 a Ara h 3 rozpoznávaných pomocí IgE a závažností klinických příznaků [37]. Flinterman a spol. [37] však nenalezli žádnou skupinu peptidů, které by souvisely se závažností příznaků. U dětí s alergií na arašídy nebo s tolerancí arašídů existují patrně rozdíly v obrazu senzibilizace, přičemž největší význam pro předpověď klinické reaktivity na arašídy má složka Ara h 2 [38]. Kromě toho byly při vyšetření pomocí technologie mikropolí s Ara h 9, Ara h 1, Ara h 2 a Ara h 3 patrné u středomořských pacientů s alergií na arašídy a broskev zjištěny zeměpisné odlišnosti v obrazu senzibilizace [39]. Ara h 9 (LTP) zřejmě hraje významnou úlohu v alergii na arašídy.

V jedné studii bylo odhaleno několik sekvenčních epitopů Len c 1 vázajících IgE [40]. Diverzita epitopu koreluje s koncentracemi IgE, což ukazuje na polyklonální odpověď IgE.

Act d 1 je možno považovat za marker skutečné senzibilizace na kiwi. Prokázalo se, že metodika mikropolí s alergenovými složkami kiwi by mohla zlepšit prognostickou hodnotu diagnostických testů in vitro [41]. Metoda ISAC (Phadia) však má nízkou senzitivitu u Act d 8 a Dau c 1 (homologie s Bet v 1 obsaženým v kiwi a mrkvi) u pacientů s anamnézou orálního alergického syndromu [42].

Nicméně Ebo a spol. [43] zjistili, že metodika mikropolí je spolehlivým nástrojem diagnostiky orálního alergického syndromu vyvolaného jablkem u pacientů s alergií na pyl břízy. Pro odlišení senzibilizace od skutečné alergie však nepřináší metodika mikropolí s rMal d 1 žádnou výhodu oproti běžnému stanovení specifických IgE proti rMal d 1.

Spojitost mezi latexem a potravinovou alergií zkoumali Radauer a spol. [44]. Pomocí metodiky mikropolí alergenů vyšetřili séra 16 408 pacientů s alergií na přítomnost IgE proti heveinu, latexové chitináze a aglutininu z pšeničných klíčků a v 58 % případů nalezli reaktivitu na hevein zprostředkovanou IgE. Domény podobné heveinu (hevein-like domain, HLD) latexové, resp. banánové a avokádové chitinázy byly pozitivní v 36 %, resp. 34 % a 15 % sér. Naproti tomu pouze 20 pacientů s alergií na banán bez současné alergie na latex bylo senzibilizováno na chitinázu HLD.

Verweij a spol. [45] zkoumali kojence s atopickou dermatitidou pomocí metody mikropolí ISAC obsahující 103 složek (Phadia) a zjistili, že většina pacientů je senzibilizována na Cor a 9, což je potenciálně nebezpečná alergenová složka lískového ořechu ze skupiny LTP. Kvantifikace specifických IgE proti Cor a 1, Cor a 8 a Cor a 9 provedená v rámci CRD pomocí metodiky mikropolí však odhalila senzibilizaci na lískový ořech pouze u 60 % pacientů, kteří byli předtím označeni jako senzibilizovaní na lískový ořech pomocí tradičního vyšetření specifických IgE. Tato odlišnost byla nejspíše způsobena chyběním složek jako Cor a 11 v dané verzi ISAC.

Současné stanovení několika izotypů specifických protilátek (IgA, IgM, IgG a IgE)

Současné stanovení různých izotypů protilátek (IgA, IgM, IgG a IgE) pomocí metody mikropolí přineslo slibné výsledky, a to i v případě, že byly na mikropole navázány celé potravinové extrakty. Díky tomuto vyšetření je možné odlišit pacienty s atopií a pozitivním provokačním testem od kontrolních osob bez atopie. Stanovení specifických IgE pomocí této metody navíc vykazuje vysokou korelaci s výsledky získanými pomocí testu ImmunoCAP (Phadia) [46].

Noh a spol. [47^••] zkoumali soubor pacientů s atopickou dermatitidou, s pozitivní anamnézou přecitlivělosti na potraviny a se zvýšenými koncentracemi specifických IgE proti různým potravinám. Stanovili u nich alergen-specifické IgE a IgG4 pomocí vlastní metodiky mikropolí a při podezření na potravinovou alergii provedli dvojitě zaslepený, placebem kontrolovaný potravinový provokační test (double-blind placebo-controlled food challenge, DBPCFC) s mlékem, vaječným bílkem, pšenicí a sójou. U všech zkoumaných potravin byly průměrné koncentrace IgE/IgG4 u pacientů s pozitivním DBPCFC vyšší než u pacientů s negativním DBPCFC. Podle poměru specifických IgE/IgG4 stanovených pomocí metodiky mikropolí bylo možné usuzovat na závažnost a progresi atopické dermatitidy.

Detekce epitopů vázajících IgE na potravinových alergenech pomocí kombinace dvou technik – technologie mikropolí a testu aktivace bazofilů

Novou slibnou možností je spojení technologie mikropolí s expozicí efektorovým krevním buňkám nesoucím na povrchu IgE. Tak by bylo možné vytvořit biologickou metodiku in vitro, která by poměrně věrně napodobovala mechanismy skutečně probíhající in vivo. Lin a spol. [48^••] pozorovali aktivaci efektorových buněk navozenou epitopy potravinových alergenů, které byly předtím přichyceny na mikropole.

Podobně Hochwallner a spol. [49] vytvořili vlastní metodu mikropolí, na něž připevnili alergeny kravského mléka, a poté stanovili profil reaktivity IgE v séru 78 jedinců senzibilizovaných na kravské mléko. Potom navázali IgE ze séra pacientů na potkaní buňky bazofilní leukémie exprimující řetězec α lidského receptoru FcεRI a hodnotili četnost rozpoznávání alergenů pomocí IgE navázaných na mikropole s následnou aktivaci bazofilů. Touto metodou bylo možné odlišit jedince s mírnými klinickými příznaky nebo bez příznaků od pacientů s těžkými systémovými nebo gastrointestinálními příznaky a stejně tak osoby, u nichž alergie na kravské mléko vyhasla, od těch, u nichž přetrvávala.

Závěr

Molekulární diagnostika pomocí technologie mikropolí otevírá novou epochu diagnostiky potravinové alergie a léčby alergických onemocnění. Umožňuje přesněji identifikovat vyvolávající agens, pomáhá odlišovat skutečnou alergii od pouhé senzibilizace, umožňuje předpovídat přirozený vývoj nebo perzistenci alergie a závažnost klinických příznaků, umožňuje přesně indikovat alergen-specifickou imunoterapii, účinněji monitorovat alergická onemocnění a v některých případech vyhnout se provedení provokačních testů a pomáhá při vedení provokačního testu, nejsou-li výsledky ostatních diagnostických metod přesvědčivé.

V diagnostice potravinové alergie mohou alergologové díky uvedené technologii stanovit obraz senzibilizace u jednotlivých pacientů a jeho odlišnosti typické pro danou zeměpisnou oblast, popřípadě odhalit senzibilizaci na molekuly odpovědné za syndromy zkřížené reaktivity.

V případech, kdy dosud nejsou k dispozici dostatečné údaje o relevanci senzibilizací zjištěných pomocí technologie mikropolí, je třeba provést další studie k jejímu ověření [50]. Současně je třeba uskutečnit studie s dostatečnou statistickou silou pro validaci této metodiky [16]. Salcedo a Diaz-Perales [13] poukázali na to, že složení panelu alergenů nemusí být vhodné pro některé zeměpisné oblasti. Je tedy třeba, aby se metodika upravila pro použití v různých zeměpisných oblastech světa, v nichž se složení alergenů rostlinného původu (pyly) i potravin významně liší.

Abychom mohli zjistit, jaké místo zaujímá technologie mikropolí v diagnostice alergií obecně a potravinové alergie obzvláště, je třeba stanovit senzitivitu, specificitu a referenční meze pro každý alergen z mikropole zvlášť u skupin pacientů se skutečnou alergií a u kontrolních osob. Nesmíme také zapomenout na to, že všechny testy in vitro by se měly hodnotit v kontextu klinické anamnézy, neboť senzibilizace nemusí vždy nutně znamenat klinickou reaktivitu. Další důležitou skutečností ke zvážení je, že řadu alergenů z případné široké škály alergenů, na něž byla zjištěna senzibilizace, může pacient tolerovat. Proto je nutné provést podrobné klinické zhodnocení a analyzovat, jaké další faktory souvisejí s klinickou reaktivitou nebo tolerancí.

Poděkování

M. L. Sanz a A. B. Blázquez byly podpořeny z grantu RD07/0064 od španělské Výzkumné sítě pro studium nežádoucích reakcí na alergeny a léčiva (Red de Investigación de Reacciones Adversas a Alérgenos y Fármacos, RIRAAF) Zdravotního ústavu Carlose III.

Adresa pro korespondenci:

Prof. Dra. Maria L. Sanz,

Departamento de Alergología e Inmunología Clínica, Facultad de Medicina, Universidad de Navarra, Apartado 4209, 31080 Pamplona, España


E-mail: mlsanzlar@unav.es

Literatura